MET70對有機磷農藥的廣譜降解特性及降解樂果機理研究

張鉦 佘夢林 袁淑博 陳曉通 劉誠 倪紅

摘要：為找尋處理磷化工污水的高效菌株，以篩選鑒定出的嗜麥芽寡養單胞菌MET70為材料，測定了其降解5種有機磷農藥的最小殺菌濃度（minimal bactericidal concentration，MBC），以及pH值、溫度對降解效果的影響，并采用HPLC初步分析了MET70對樂果的降解機理。結果表明：MET70對氧樂果、樂果、敵敵畏、甲基對硫磷和毒死蜱5種農藥有廣譜降解效果，降解5種農藥的最適pH分別為8.0、8.0、9.0、7.0和9.0，對應的降解率分別為64.8%、46.36%、50.22%、31.36%和84.01%;最適溫度分別為30℃、35℃、30℃、30℃和35℃，對應的降解率分別為64.21%、47.83%、45.8%、32.98%和77.7%。MBC從大到小依次為：樂果（1024）>氧樂果（1024）≈敵敵畏≈甲基對硫磷>毒死蜱（256），對樂果的耐受能力最強。在搖瓶實驗中，MET70在120h里，對50mg/L樂果的降解率達89.66%。其中，MET70對樂果和氧樂果的降解穩定性最好。用HPLC檢測分析MET70降解樂果過程中，沒有新的物質出現，從而初步判斷MET70對樂果的降解是完全礦化作用。對有機磷農藥而言，MET70是一株具有廣譜耐受力和降解能力的菌株。

關鍵詞：嗜麥芽寡養單胞菌;有機磷農藥;廣譜降解;機理

中圖分類號：0657

文獻標識碼：A

文章編號;1674-9944（2018）10-0041-05

1引言

我國是一個農業大國，為保證農作物增產保豐，不可避免地施用大量的化肥和農藥。有機磷農藥作為一種廣譜、高效的殺蟲劑，使用量占農藥總量的40%左右，有機磷農藥具有高毒性、難降解的特點，會對環境造成嚴重危害。一般情況下，化學磷肥和有機磷農藥的當季利用率僅有10%～20%，土壤中未利用的化肥和殘留農藥隨著灌水和降雨等淋溶作用不斷匯入地表水、地下水，不僅造成磷資源浪費，還直接導致了地表水富營養化。目前對于作物生長過程中的化肥農藥減施增效技術已成為當前研究熱點。其中微生物除磷技術的研究最為廣泛。嗜麥芽寡養單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）是一種廣泛存在于土壤、水體和植物根系的革蘭氏陰性桿菌，其代謝功能多樣化。田江等人篩選出一株嗜麥芽寡養單胞菌TPSB1具有溶磷和重金屬抗性作用;Dubey KK等人口從狼尾草根部得到一株嗜麥芽寡養單胞菌MHF ENV20，能表達有機磷水解酶（mpd），對受毒死蜱污染的土壤有很好的的生物修復作用;Shen Y J等人發現一株對有機磷農藥有廣譜降解作用的菌株SMSP-l對甲基對硫磷（PNP）、殺螟硫磷、乙基對硫磷、倍硫磷、辛硫磷等都有一定的降解能力等。

從磷化工污水處理廠的活性污泥中，篩選鑒定出一株具有高效聚磷作用的嗜麥芽寡養單胞菌MET70，以該菌株為材料，研究了該菌株對氧樂果、樂果、敵敵畏、甲基對硫磷和毒死蜱等5種不同有機磷農藥的最小殺菌濃度（MBC），以及pH值、溫度對降解效果的影響，并采用HPLC法對樂果的降解機理進行了初步分析，以期為該多功能菌株在磷化工污水處理中更好地應用，提供實驗依據。

2材料和方法

2.1菌株、試劑和儀器

從某污水處理廠活性污泥中，篩選得到的具有高效聚磷作用的嗜麥芽寡養單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia） MET70作為實驗菌株，來探討它的降解有機磷農藥特性。

毒死蜱標品、敵敵畏標品、樂果標品、氧樂果標品、甲基對硫磷：均購于Achemtek Co.，Ltd.（USA），色譜級乙腈（純度為：99.8%）購于MREDA，其他常規試劑均為分析純，購于國藥化學集團化學試劑有限公司。

高效液相色譜儀（HPLC）：型號，島津LC20-AT。

2.2培養基

LB培養基：蛋白胨10g、酵母浸膏5g和Naci5g，蒸餾水定容至1000mL，pH值7.0～7.2。用于菌株的活化和保藏。

MSM基礎培養基（Murashig and Skoog Medium）：K2HP041.5g、KH2P040.5g、MgS04·7H200.2g、NaCl1.0g和（NH4）2SO41.0g，蒸餾水定容至1000mL，農藥待培養基冷卻至50℃左右時加入。用于農藥的降解試驗。

以上均121℃高壓滅菌20min后使用。所有固體培養基是在液體培養基的基礎上添加2%的瓊脂粉。

農藥標準液的配制：①毒死蜱標準液（5g/L）。用色譜級乙腈溶解，依次稀釋成0.1、1.0、10、50、100、200mg/L系列濃度。②敵敵畏1000mg/L標準液。用色譜級甲醇，依次稀釋成0.1、1.0、10、50、100、200mg/L的系列濃度。③樂果標準液（5g/L）。用色譜級乙腈溶解，依次稀釋成0.1、1.0、10、50、100、200mg/L系列濃度。④氧樂果標準液（5g/L）。用色譜級乙腈溶解，依次稀釋成0.1、1.0、10、50、100、200mg/L系列濃度。⑤甲基對硫磷1000mg/L標準液。用色譜級甲醇，依次稀釋成0.1、1.0、10、50、100、200mg/L的系列濃度。

以上農藥標準液使用前均使用0.22nm微孔過濾除菌。

2.3實驗方法

2.3.1MET70對5種有機磷農藥的廣譜降解實驗

（1）MET70對5種有機磷農藥的最小殺菌濃度（MBC）實驗。

①用滅菌蒸餾水分別將5種有機磷農藥（氧樂果、敵敵畏、甲基對硫磷、毒死蜱和樂果）按梯度稀釋配成終濃度1、4、16、64、256和1024mg/L的溶液，并將9.9mL農藥稀釋液分裝入10mLEp試管內。

②復蘇MET70.收集菌體并用無菌水調至菌液濃度OD600nm=1.0。

③分別將100цL菌液加入配制好的不同濃度的Ep管中。同時設陽性對照（不加農藥處理）和陰性對照（不加菌液處理），每組設3次重復。

④將農藥與菌體的混合液在28℃，150r/min下培養24h。

⑤將LB平板均勻劃分為8個區域，用接種環按梯度蘸取各實驗管內的混合液，在劃分區域以Z字型劃線。

⑥將平板倒置28℃，培養36～48h，每隔12h觀察菌落生長狀況，并拍照記錄。

⑦評估細菌細胞在平板各區域的生長情況，其中開始無細菌生長的濃度即為最小殺菌濃度（MBC）。

（2）農藥標準曲線的繪制。將上述農藥標準品配制成不同濃度的溶液，經o.22μm孔徑濾膜過濾后，采用高效液相色譜法（HPLC）測定。

洗脫過程使用hypeisd ODS2（C18 reverse-phase）column（4.6mm*250mm;dp：5μm）反相色譜柱，進樣體積20μL。5種農藥的洗脫條件見表1。以農藥對應的特征峰面積為縱坐標，標樣的濃度（mg/L）為橫坐標繪制標準曲線，各農藥的濃度標準曲線及洗脫特性見表2。

（3）pH對MET70菌株降解5種有機磷農藥的效果影響。研究不同pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0）對MET70降解5種農藥效果的影響。將MET70菌懸液（OD600nm=1.0）按2%的接種量分別加入含有不同農藥的MSM基礎培養基（農藥終濃度50mg/L）中，在28℃，150r/min培養5d后取樣，進HPLC檢測，將HPLC外標峰面積帶入各農藥的標準曲線得到相應的農藥濃度，在不同pH條件下，MET70對農藥的降解效率公式如下：

降解率（%）=（1-A/A。）×100%

式中，Ao為農藥的初始濃度;A為農藥的殘留濃度

上述實驗都以等量無菌水代替MET70菌液作為對照。設置3個重復并取平均值進行作圖。

（4）溫度對MET70菌株降解五種有機磷農藥的效果影響。研究不同溫度（20、25、30、35、40和45℃）對MET70降解5種農藥效果的影響。將MET70菌懸液（OD600nm=1.0）按2%的接種量分別加入含有不同農藥的MSM基礎培養基（農藥終濃度50mg/L）中，在最適pH值條件下，150r/min培養5d后取樣，HPLC法測定農藥的殘留濃度，并計算不同溫度下MET70對農藥的聚磷率，計算方法同上。上述實驗都以等量無菌水代替菌液作為對照。每組實驗重復三次。

2.3.2MET70菌株降解樂果機理研究

（1）MET70菌株的生長曲線和降解樂果曲線。將OD600nm=1.0的MET70菌懸液，按照2%的接種量加入樂果終濃度為50mg/L的無機鹽培養基中（pH一9.0），在28℃，150r/min條件下，每隔一段時間（0、6、12、18、24、30、36、42、48、60、72、84、96和120h）取樣。將樣品于12000r/min離心5min，菌體用PBS重懸后，測定OD600nm，繪制出菌的生長曲線;同時利用高效液相色譜分析上清液中樂果含量的變化，并計算降解率，計算方法同上。所有實驗均重復3次取平均值。繪制MET70降解樂果的降解曲線，分析MET70否能利用樂果做唯一碳源進行生長。

（2）MET70菌株降解樂果機理分析。用高效液相色譜對上述MET70降解樂果過程中，按照0、12、24、36、72和120h時間間隔取樣分析，并對峰形進行疊加處理，分析降解樂果過程中是否有新物質的產生。

3結果與分析

3.1MET70菌株對5種有機磷農藥的廣譜降解實驗

3.1.1MET70菌株對5種有機磷農藥的最小殺菌濃度（MBC）實驗

MET70菌體與6個濃度梯度（1、4、16、64、256和1024mg/L）的5種農藥共培養24h后，5種農藥的耐受范圍和最小殺菌濃度（MBC）見圖1。

由圖1可知，氧樂果（A）、敵敵畏（B）和甲基對硫磷（C）對MET70的最小殺菌濃度（MBC）均為1024mg/L：菌株對3種農藥的耐受范圍高于256mg/L，低于1024mg/L。毒死蜱對MET70的毒性作用較大，MBC為256mg/L：對毒死蜱的耐受濃度高于64mg/L，低于256mg/L。

樂果對MET70的MBC超過1024mg/L：當樂果濃度達到1024mg/L時，仍有部分菌體能夠維持活性，說明MET70對樂果的耐受能力最強。

實驗表明，MET70對5種有機磷農藥都有一定的耐受作用，耐受能力從大到小依次為：樂果>氧樂果≈敵敵畏≈甲基對硫磷>毒死蜱;初步推測MET70對5種農藥的降解能力與耐受能力呈正相關，即對農藥的耐受能力越強，降解潛力越大。

3.1.2pH值對MET70菌株降解5種有機磷農藥的效果影響

不同pH值條件下，MET70菌株對5種有機磷農藥的降解率，如圖2所示。由圖2可知，降解5種農藥的最適pH由上到下，依次為8.0、8.0、9.0、7.0和9.0，對應的降解率分別為64.8%、46.36%，50.22%、31.36%和84.01%。其中，對樂果的降解效果最明顯，氧樂果次之，且MET70在pH值7.0～10.0的范圍內對兩種農藥的降解穩定性較好，均能維持在55%以上;對甲基對硫磷和敵敵畏的降解受pH值影響較大，穩定性不高;對毒死蜱的降解效果雖然最弱，但降解效果受pH值影響不大，穩定性較好。

可見，MET70對5種有機磷農藥有廣譜降解效果，且降解特性總體與耐受性規律基本一致，最適pH值范圍在7.0～9.0之間，更適宜在堿性條件下發揮降解作用。

3.1.3溫度對MET70菌株降解5種有機磷農藥的效果影響

不同溫度條件下，MET70對5種農藥的降解效率，結果見圖3。由圖3可知，MET70對降解5種農藥的最適范圍在30～35℃之間，最適溫度由上到下，依次為30℃、35℃、30℃、30℃和35℃，對應的降解率分別為64.21%、47.83%、45.8%、32.98%和77.7%。其中，MET70對樂果和氧樂果的降解穩定性最好，對毒死蜱，敵敵畏和甲基對硫磷的降解效果受溫度影響較大。溫度降解特性與pH值降解特性相似，對樂果和氧樂果的降解行能和穩定性尤為突出。

3.2MET70菌株降解樂果機理研究

3.2.1MET70菌株的生長曲線和降解樂果曲線

MET70在MSM液體培養基（樂果含量為50mg/L）中，28℃、150rpm下培養120h，在不同時間點（0、6、12、18、24、30、36、42、48、60、72、84、96和120h）下的MET70生長量及相應的樂果降解率如圖4所示。

由圖4可知，MET70對樂果的降解效率隨培養時間的變化而改變：在0～6h時，MET70菌體生長速度緩慢，對樂果的降解幾乎停滯;在6～12h時，MET70進入對數生長期，此時菌濃度迅速增至1.299，樂果濃度由50.12mg/L下降到36.27mg/L，對樂果的降解效率逐漸增大至27.46%;在12～36h時，MET70生長進入穩定期，降解速率較對數期變緩，菌濃度逐漸穩定在OD800nm=1.831，對樂果的降解率為63.62%;在隨后的84h內，MET70的生長量處于動態平衡，降解效率為85.3%;在120h樂果濃度降到最低5.17mg/L，此時樂果的降解效率約89.66%。

結果表明，MET70能夠利用樂果作唯一碳源進行生長代謝，但生長周期較正常營養條件下的有所延長。在0～36h時，MET70的細胞密度由0.02增加到1.831（OD600nm），且MET70的降解趨勢與細菌的生長曲線幾乎一致，說明在此期間，MET70降解樂果供自身生長代謝所需;而36～120h，菌體處于穩定期向衰亡期過度時期，此時樂果濃度的繼續緩慢下降，可能是與有機磷水解酶的活性下降有關。

3.2.2MET70菌株降解樂果機理分析

在MET70菌株在降解樂果的搖瓶實驗中，每隔一定時間（0、12、24、36、72和120h）進行取樣，用高效液相色譜檢測，并將峰形圖進行疊加處理，結果見圖5。

由圖5可知，隨著取樣時間的延長，樂果的特征峰（出峰時間約5.583min）面積不斷減小，0～36h內，MET70對樂果降解速率較快，峰面積減小了約3/4;36～72h內，對樂果降解速度逐步變緩;72～120h內，樂果降解幾乎停滯。該結果與圖4的結果相吻合，在菌體增殖過程中對樂果的降解速率較快，進入穩定一衰亡期后，菌體對樂果仍有一定的降解能力。圖5還顯示MET70降解過程中無新的中間產物出現，初步預測MET70對樂果的降解為完全礦化作用。

4討論

本實驗室從湖北某污水處理廠的活性污泥中，篩選出一株具有高效的聚磷作用的嗜麥芽寡養單胞菌（命名為MET70），其對氧樂果、敵敵畏、甲基對硫磷、毒死蜱、樂果等有機磷農藥具有廣譜耐受力和降解能力，在pH值（7.0～9.0）和溫度（30～35℃）范圍內，表現出廣泛的適應性和穩定性。

研究MET70降解樂果的特性時，雖然降解過程無新的物質峰出現，但無直接證據表面MET70對樂果降解為礦化作用，可能是中間產物直接參與了菌體的生長代謝，或是出現了不穩定中間產物未被檢出。因此，有必要縮短間隔取樣時間對降解樂果的途徑作進一步研究，再利用GC-MS檢測物質結構，結合基因數據分析可能的降解過程。