新生血管生成抑制劑治療膝骨性關節炎大鼠的療效研究

朱磊 王金杰 張佳穎 莊汝杰

膝骨性關節炎（KOA）是骨科臨床常見病、多發病，是中老年人致殘的主要因素之一[1]。相關研究表明血管內皮生長因子（VEGF）在KOA軟骨退變過程中具有重要作用[2]，且能刺激軟骨細胞產生多種基質降解酶[3]，其中基質金屬蛋白酶13（MMP－13）是最重要也是最有效的Ⅱ型膠原纖維降解酶。本研究建立KOA大鼠模型并用新生血管生成抑制劑舒尼替尼進行治療，觀察治療后不同時點VEGF、MMP－13表達水平的變化，為防治KOA提供新思路。現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 4～5月齡健康SD雄性大鼠32只，體重（190±10）g，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供。1.2 主要試劑及器材 木瓜蛋白酶（批號：MB3052，美國 MERK 公司）、舒尼替尼（50mg，批號：H20130261，美國 sigma公司）、VEGF ELISA試劑盒（96T，批號：EIA06604r，武漢新啟迪生物科技有限公司）、MMP－13 ELISA 試劑盒（96T，批號：EIA06074r，武漢新啟迪生物科技有限公司）、電子恒溫箱（型號：HPX－9052 MBE，上海博迅實業有限公司）、臺式離心機（型號：SORVALL，德國Heraeu公司）、酶標分析儀（型號：DNM－9602，北京普朗新技術有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組 將32只大鼠隨機分為4組，即空白組、治療4周組、治療8周組及對照組各8只。4組大鼠在相同條件下籠養，自由攝食，飲水，室溫控制在18～22℃。

1.3.2 造模方法 在常規無菌下操作。提前從冰箱取出木瓜蛋白酶，靜置30min；配置含4%木瓜蛋白酶的0.9%氯化鈉溶液，充分振蕩、混勻。空白組大鼠不作任何處理，其余3組大鼠分別于第1、3、5天關節腔注射含4%木瓜蛋白酶的0.9%氯化鈉溶液，進行KOA造模。具體操作如下：使用呼吸麻醉機使大鼠麻醉，仰臥位固定于木板上，剃去左、右膝關節腔周邊1cm區域的腿毛，絡合碘消毒，體積分數75%的乙醇脫碘；屈曲45°以髕骨下級髕腱外緣為進針點，向髁間窩方向進針，抵達股骨髁后回撤2mm，注入0.2ml含4%木瓜蛋白酶的0.9%氯化鈉溶液；2周后，KOA模型建立[4]。

1.3.3 給藥方法 KOA造模成功后，空白組不給任何藥物；治療 4 周組大鼠灌胃舒尼替尼 1mg·kg－1·d－1，持續4 周；治療 8 周組大鼠灌胃舒尼替尼 1mg·kg－1·d－1，持續8周；對照組每天灌胃同等體積的0.9%氯化鈉溶液。4組大鼠自由攝食，飲水，室溫控制在18～22℃。

1.3.4 指標檢測 實驗結束后，麻醉大鼠作脫頸處死，切開雙膝關節腔，1ml 0.9%氯化鈉溶液沖洗關節腔，使0.9%氯化鈉溶液與關節液充分混合，用注射器抽取收集關節液標本。4 000r/min離心5min，取上清液，置于－20℃冰箱下密封保存；采用ELISA法檢測關節液中 VEGF、MMP－13 表達水平。

1.4 統計學處理 應用SPSS 19.0統計軟件。計量資料用表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組大鼠關節液中VEGF表達水平比較 與對照組比較，治療4周組、治療8周組大鼠關節液中VEGF表達水平均明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；治療4周組與治療8周組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05），見表1。

表1 4組大鼠關節液中VEGF表達水平比較

2.2 4組大鼠關節液中MMP－13表達水平比較 與對照組比較，治療4周組、治療8周組大鼠關節液中MMP－13表達水平均明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；治療4周組與治療8周組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 4組大鼠關節液中MMP-13表達水平的比較

3 討論

KOA是一種多發于中老年的慢性退行性疾病，以關節軟骨退行性變、骨贅形成、滑膜炎癥為主要特征，臨床表現為慢性關節疼痛、僵硬、肥大及活動受限。其病因目前尚不明確，普遍認為與年齡、性別、肥胖、磨損、內分泌、生化、種族、遺傳、細胞因子、免疫等因素有關。KOA的發病機制及治療一直是骨科學研究者和骨科臨床醫生所面臨的重要問題。

成人膝關節關節軟骨是一種無血管組織，軟骨細胞是關節軟骨的唯一細胞成分，具有產生和維持細胞外軟骨基質的作用[5]。軟骨細胞生存在一個相對缺氧的環境中，主要是以無氧代謝來產生高能磷酸鍵。相關研究表明，一些血管生成因子（如VEGF）參與了軟骨的代謝，并在KOA的進展中發揮重要作用[6]。Horner等[7]研究結果表明，正常軟骨細胞幾乎不分泌VEGF；而KOA患者關節液中有大量VEGF，從而促進新生血管生成，導致軟骨下骨的破骨性吸收，使得軟骨結構被破壞。Tsai等[8]、賈奇學等[9]研究表明，KOA患者關節液中有大量的促炎性細胞因子，VEGF通過上調軟骨細胞MMP－13表達，從而促進KOA的病情發展。MMP－13是最重要、最有效的Ⅱ型膠原纖維降解酶，也是KOA發病過程中其他金屬蛋白酶亞型對Ⅱ型膠原產生降解作用的最主要靶點。有文獻報道在KOA病變部位的軟骨中，MMP-13 mRNA表達程度與其組織損壞程度基本一致[10]。VEGF能刺激軟骨細胞產生大量金屬蛋白酶，使MMP-13的表達增加，從而破壞原來與金屬蛋白酶抑制劑之間的平衡狀態，加速Ⅱ型膠原的降解，最終導致軟骨結構的進一步破壞。

VEGF作為重要的血管調控因子，能與其受體VEGFR特異性結合，促進新生血管的增生。舒尼替尼作為一種多靶點的小分子胞內酪氨酸激酶抑制劑，主要通過選擇性抑制 VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3及血小板源性生長因子受體（PDGFR），來達到阻斷VEDF/VEGFR信號通路，抑制新生血管增生[11]，從而起到治療KOA的作用。本實驗結果表明，實驗前4周大鼠關節液中VEGFR表達水平升高，而舒尼替尼能有效抑制VEGFR的表達，減輕對關節軟骨的破壞；同時使MMP-13表達下調，減慢Ⅱ型膠原的降解，保護軟骨結構免被進一步破壞。實驗后4周，關節液中VEGFR表達水平較低，舒尼替尼的抑制效果與VEGFR表達水平趨于平衡，將VEGF、MMP-13的表達維持在較低水平。

綜上所述，新生血管生成抑制劑舒尼替尼能有效降低關節液中VEGF、MMP-13表達水平，長期用藥可將VEGF和MMP-13的表達維持在較低水平，從而達到防治KOA的作用。本實驗為KOA的防治提供了新思路，也為新類藥物的研發提供了實驗基礎。

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[5]袁芳,何曉瑾,邱亦江,等.骨關節炎的軟骨細胞凋亡機制[J].實用醫學雜志,2015,31(4):666-668.

[6]劉秀麗,滕蔚然,金立倫.等.血管內皮生長因子在骨關節炎中的研究進展[J].醫學綜述,2014,20(17):3092-3094.

[7]Horner A,Bishop NJ,Bord S,et al.Immunolocalisation of vascular endothelial growth factor(VEGF)in human neonatal growth plate cartilage[J].Journalof Anatomy,1999,194(4):519-524.

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