miR-34b促進關節軟骨細胞基質退變的分子機制研究

王丹丹 陳剛 葉俏 鮑軼 官俏兵

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種以關節軟骨退變為主要特征的關節疾病，它是導致老年人慢性肌肉骨骼疼痛和活動障礙的最主要原因，但是目前關于OA的發病機制尚未完全清楚。微小RNA（miRNA）是一類小分子非編碼RNA，具有保持和調節人體正常生理功能的重要作用。有研究發現miRNA異常表達與OA的發生密切相關[1]，但關于miR-34b在OA中的生理功能和潛在的分子機制尚不明確。故本研究檢測miR-34b在OA軟骨細胞中的表達，通過轉染miR-34b的模擬物或抑制物調節軟骨細胞內miR-34b的表達量，探索其對軟骨細胞基質代謝和Smad3表達的影響；同時檢測miR-34b是否直接靶向Smad3，進而初步解釋miR-34b在OA發病機制中的作用，為OA的預防與治療提供新的切入點。

1 材料和方法

1.1 標本來源 標本來自2014年6月至2015年10月本院骨科收治的住院患者。OA軟骨組織標本取自10例行全膝關節置換的OA患者（依據美國風濕病協會OA診斷標準診斷為膝關節終末期OA[2]）的膝關節，排除有糖尿病、骨骼發育障礙性疾病、其他類型關節炎、腫瘤、感染、其他慢性炎癥性疾病以及糖皮質激素治療史者。正常膝關節軟骨組織標本取自7例因車禍而截肢患者的膝關節，排除有糖尿病、關節痛、關節功能受限、其他類型關節炎罹患史、惡性腫瘤以及糖皮質激素治療史者。本實驗使用的人軟骨組織標本符合醫學倫理學原則，標本采集取得所有患者的知情同意。

1.2 儀器及試劑 人軟骨肉瘤細胞株SW1353購自中國科學院細胞庫；DMEM/F12培養基、FBS、青霉素、鏈霉素均購自美國Gibco公司；胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶均購自美國sigma公司；Lipofectamine 2000、Trizol試劑均購自美國Invitrogen公司；實時定量反轉錄聚合酶鏈反應 （RT-qPCR）試劑盒購自日本Toyobo公司；2×Taq PCR Master Mix購自美國Applied Biosystems公司；經過特殊化學修飾的miR-34b模擬物（miR-34b mimic）、miR-34b抑制物（miR-34b inhibitor）、無義序列均購自廣州銳博生物公司；PCR儀購自美國Biometra公司；恒溫CO2培養箱購自德國Heraeus公司。

1.3 軟骨細胞的分離、培養及轉染 將收集的OA軟骨組織和正常膝關節軟骨組織置于無菌培養皿，0.25%的胰蛋白酶37℃消化30min，PBS清洗；剪碎軟骨組織至1mm×1mm×1mm大小，加0.2%的Ⅱ型膠原酶，置搖床上37℃消化5h；過濾器過濾，收集濾液，離心收集細胞；將細胞懸浮于含10%FBS、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的DMEM/F12培養基中。SW1353細胞用含有10%FBS、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的DMEM/F12培養基，在37℃、5%CO2的培養箱中培養，每2d更換1次培養液。轉染時SW1353細胞接種在6孔板內，待80%細胞匯合后用Lipofectamine 2000轉染，參照說明書進行操作。實驗設4組：空白對照組（只加入等量的脂質體，A組）、SW1353細胞轉染無義序列組（B組）、SW1353細胞轉染miR-34b mimic組（C組）、SW1353細胞轉染miR-34b inhibitor組（D組）。

1.4 RT-qPCR 引物設計及合成委托英駿生物技術有限公司進行，各基因的引物序列見表1。以Trizol試劑、氯仿提取軟骨細胞的總RNA，異丙醇沉淀回收RNA，75%乙醇洗滌RNA沉淀。取≤1μg的RNA，以各基因引物片段為特異引物，用ReverTra Ace-α-試劑盒合成cDNA。PCR反應條件：94℃ 5min；然后進入94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min的循環（共40次）。以β-actin和 U6分別作為mRNA和miRNA的內參，計算機分析Ct值，采用2-△△Ct法計算相對表達量，即miR-34b表達水平。

表1 RT-qPCR反應引物序列

1.5 熒光素酶報告基因實驗 使用Targetscan基因信息軟件預測得到Smad3是miR-34b靶基因，構建Smad3 野生型及突變型 3′非編碼區（3′-UTR）-熒光素酶報告載體，利用熒光素酶報告基因實驗檢測miR-34b對Smad3基因野生型及突變型3′-UTR熒光素酶活性的影響。293T細胞使用DMEM/F12培養基，在37℃、5%CO2的培養箱中培養；將熒光素酶報告載體與miR-34b mimic及對照組無義序列共轉染293T細胞，36h后收獲細胞；使用熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.6 統計學處理 應用SPSS 15.0統計軟件。計量資料用表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OA軟骨組織與正常膝關節軟骨組織中miR－34b表達水平比較 OA軟骨組織中miR－34b表達水平（2.79±1.94）明顯高于正常膝關節軟骨組織（0.11±0.17），差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 SW1353細胞轉染后miR－34b表達水平 SW1353細胞轉染后，與A組miR－34b表達水平（0.12±0.19）比較，C 組（3.79±0.11）明顯升高，D 組（0.01±0.03）明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；A組與B組（0.11±0.18）比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。

2.3 熒光素酶報告基因實驗結果 經生物信息學軟件預測，Smad3是miR－34b的潛在靶基因。熒光素酶報告基因實驗證實，共轉染miR－34b mimic與pMiR－ReportTM－Smad3野生型3′－UTR質粒后，熒光強度較轉染無義序列、pMiR－ReportTM－Smad3 野生型 3′－UTR質粒均明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；共轉染 miR－34b mimic與pMiR－ReportTM－Smad3突變型3′－UTR質粒后，熒光強度與轉染無義序列、pMiRReportTM－Smad3 突變型 3′－UTR 質粒比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）；提示miR－34b可特異性地與Smad3的3′－UTR結合。RT－qPCR法進一步檢測轉染miR－34b mimic和 miR－34 inhibitor后 Smad3基因mRNA 表達水平，與A 組（0.51±0.12）比較，C組（0.07±0.04）明顯降低，D 組（1.12±0.06）明顯升高，差異均有統計學意義（均 P＜0.05）；A 組與 B 組（0.52±0.08）比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.4 轉染后SW1353細胞中Ⅱ型膠原、MMP－13的mRNA表達水平 轉染后，與A組比較，C組Ⅱ型膠原mRNA表達水平明顯降低，D組明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；C組MMP－13 mRNA明顯升高，D組明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2 4組不同條件下細胞的Ⅱ型膠原、MMP-13 mRNA表達水平比較

3 討論

早期診斷、早期治療OA具有重要的臨床意義。miRNA是一類內源性非編碼小分子RNA，普遍存在于在動物和植物中，在基因表達方面有重要的調控作用。miRNA通過與靶mRNA的3′－UTR結合，進而降解靶mRNA或抑制mRNA轉錄后翻譯，調節蛋白質的生成，從而發揮效應[3－4]。在生物發育的不同階段，miRNA對細胞的增殖、分化和凋亡等過程均有影響，因此它能對機體發育、體內穩態的保持和骨代謝等過程進行調解[5－6]。miRNA異常表達可能會引起OA，如Iliopoulos等[7]發現人OA軟骨細胞內miR－140表達水平明顯下降，Miyaki等[8]通過構建miR－140基因缺失小鼠，成功誘導出以蛋白多糖丟失、關節軟骨纖維化為特征的OA樣改變。因此，確定OA中miRNA發揮作用的分子機制非常重要。本實驗結果證實，OA軟骨細胞中miR－34b表達水平較正常軟骨細胞明顯增加。

miRNA需要通過與其靶基因相互作用，從而發揮調節基因表達的功能。因此，首先要尋找miR－34b靶基因。筆者使用Targetscan基因信息軟件預測，發現Smad3 mRNA的3′UTR中含有與miR－34b互補結合的序列。進一步作熒光素酶報告基因實驗，證實Smad3是miR－34b的直接靶基因，且在SW1353細胞中過表達miR－34b后，Smad3 mRNA表達水平明顯下調。以上結果表明Smad3是miR－34b的功能介導者。轉化生長因子－β（TGF－β）信號通路在軟骨細胞的分化、增殖和成熟以及軟骨基質的合成中具有重要的調節作用，TGF－β信號通路異常與OA的發生密切相關[9]。Smad3是連接細胞外TGF－β信號的細胞內分子，在缺乏Smad3的小鼠中可觀察到OA癥狀[10]。另外，過表達的Smad3會提高軟骨形成過程中軟骨細胞的生長和分化，下調Smad3會減弱這個過程[11]。本實驗結果顯示，miR－34b可能通過抑制Smad3的活性，從而影響TGF－β信號通路，促進軟骨細胞分解代謝，加速軟骨基質降解，最后導致OA。

本研究進一步驗證miR－34b在OA發病機制中的作用，即轉染miR－34b mimic或inhibitor上調或抑制SW1353細胞中miR－34b的表達后，利用RT－qPCR檢測Ⅱ型膠原mRNA表達水平。實驗結果顯示miR－34b mimic轉染后，Ⅱ型膠原mRNA表達下調，而miR－34b inhibitor會上調Ⅱ型膠原mRNA表達。以上結果提示miR－34b可以抑制軟骨細胞的合成代謝能力。MMP－13在OA的發病機制中具有重要作用[12]。本研究結果發現，當軟骨細胞轉染miR－34b mimic時，MMP－13 mRNA表達水平明顯升高；轉染miR－34b inhibitor時，MMP-13 mRNA表達水平明顯下降。前期相關研究報道在人和鼠軟骨細胞中，降低Smad3表達水平會導致MMP-13表達水平升高[13]。以上結果表明，miR-34b可能通過靶向抑制Smad3的表達，從而促進軟骨細胞基質的分解代謝。

綜上所述，miR-34b在OA軟骨細胞中表達明顯上調；miR-34b可能通過靶向調節Smad3的表達，誘導人關節軟骨細胞基質退變，進而促進OA的發展。關節軟骨細胞中miR-34b的功能研究可為OA的預防與治療提供新的切入點，建議多關注其影響軟骨基質代謝的分子機制研究，這可能為OA的防治開拓新的領域。

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