姜黃素對人巨細胞病毒感染人胚肺成纖維細胞后細胞凋亡的影響

賈陽杰 呂亞麗 劉麗宏

[摘要] 目的 探討人巨細胞病毒（HCMV）感染人胚肺成纖維細胞后細胞凋亡情況，以及姜黃素對HCMV感染細胞后細胞凋亡的影響。 方法 將細胞分為細胞對照組（細胞維持液），病毒模型組（細胞維持液+HCMV），姜黃素大（細胞維持液+HCMV+姜黃素0.8 μg/mL）、中（細胞維持液+HCMV+姜黃素0.4 μg/mL）、小（細胞維持液+HCMV+姜黃素0.2 μg/mL）劑量組，更昔洛韋組（細胞維持液+HCMV+更昔洛韋50 μg/mL），運用線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）和熒光染料碘化丙啶（PI）法檢測姜黃素對HCMV感染的細胞凋亡的影響。 結果 JC-1法實驗結果顯示：HCMV感染早期，病毒模型組細胞凋亡情況與細胞對照組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）；與病毒模型組比較，更昔洛韋組和姜黃素大、中、小劑量組細胞凋亡顯著增加（P < 0.05）。HCMV感染晚期，與細胞對照組比較，病毒模型組細胞凋亡顯著增加（P < 0.05）；與病毒模型組比較，姜黃素大、中、小劑量組細胞凋亡均有不同程度降低，其中姜黃素大劑量組與病毒模型組比較差異有統計學意義（P < 0.05）。熒光染料PI法實驗結果顯示：在HCMV感染早期及晚期，與細胞對照組比較，病毒模型組S期細胞顯著增多（P < 0.01）；與病毒模型組比較，姜黃素大、中、小劑量組S期細胞均明顯減少（P < 0.05）。 結論 姜黃素能夠對抗HCMV感染引起的細胞凋亡作用，可使HCMV感染早期誘導的抗凋亡作用和HCMV感染晚期誘導的促凋亡作用減弱。

[關鍵詞] 姜黃素；人巨細胞病毒；細胞周期；細胞凋亡

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）12（a）-0004-07

細胞凋亡（apoptosis），又稱程序性細胞死亡（programmed cell death，PCD）是指細胞主動死亡的現象。機體出現細胞凋亡主要是為了能夠保持組織、器官的正常形態、功能和內環境的穩態[1]。大量實驗研究發現，機體感染人巨細胞病毒（HCMV）后產生的臨床表現，跟PCD的發生密切相關[2]。

HCMV是β皰疹病毒亞科的雙鏈線狀DNA病毒。在大多數發達國家，大約50%的成年人既往感染HCMV，在世界發展中地區，HCMV感染在大齡兒童和成年人群中甚至高達90%～100%[3]。HCMV一旦侵入人體將長期或終身存在于體內，正常人一般為潛伏感染或無癥狀的亞臨床感染，而在放化療后、器官移植術后的腫瘤患者等免疫功能不全或低下的易感人群中，感染HCMV后常常引起多系統的病變，甚至造成致死性的危險[4]。

研究發現，HCMV感染后，機體的免疫系統并不能將其全部消滅清除，并且HCMV還可以潛伏于細胞中[5]。HCMV與PCD密切相關且兩者之間的聯系較為復雜，研究者發現，HCMV感染后，在不同的條件下，既可表現為抑制細胞的凋亡，也可表現為加快細胞的凋亡[6]。姜黃素是從姜黃屬中提取出的一種酚性色素，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等藥理作用。故本研究擬通過運用線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）和熒光染料碘化丙啶（PI）的方法來探討HCMV感染人胚肺成纖維細胞后細胞凋亡情況，以及姜黃素對HCMV感染細胞后細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 病毒及細胞

HCMV AD169株由華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院婦科和兒科臨床病毒研究室提供。人胚肺成纖維細胞（HELF株）購自國家實驗細胞資源中心，實驗所用細胞為20～25代細胞。

1.2 藥物

注射用更昔洛韋（GCV）（美國Sigma公司，貨號：Y0001129）；姜黃素單體（批號：062-20170321，含量99.116%）由首都醫科大學附屬北京朝陽醫院（以下簡稱“我院”）藥事部自制；姜黃飲片來自江西江中中藥飲片有限公司，由我院中草藥房藥師鑒定為真品，批號：160801，GMP證號：贛JX20120017。

1.3 主要試劑及儀器

MEM培養基購自美國HyClone公司；二甲基亞砜（DMSO）、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、青霉素G（Penicillin G）、Hank′s液、鏈霉素（Streptomycin）、羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）均購自美國Sigma-Aldrich公司；JC-1購自北京泛博生物化學有限公司；PI染色液購自美國Sigma公司；流式細胞儀購自美國BD公司。細胞培養液為MEM培養基+Penicillin G（100 U/mL）+Streptomycin（100 μg/mL）+10%FBS。細胞維持液為MEM培養基+Penicillin G（100 U/mL）+Streptomycin（100 μg/mL）+2%FBS。

1.4 JC-1法檢測細胞凋亡

將HELF細胞在96孔板中培養成單層細胞，將細胞分為六組，分別為細胞對照組（細胞維持液），病毒模型組（細胞維持液+HCMV），姜黃素大劑量組（細胞維持液+HCMV+姜黃素0.8 μg/mL）、中劑量組（細胞維持液+HCMV+姜黃素0.4 μg/mL）和小劑量組（細胞維持液+HCMV+姜黃素0.2 μg/mL）、更昔洛韋組（細胞維持液+HCMV+GCV 50 μg/mL），更昔洛韋為陽性對照藥。病毒感染滴度為100 TCID50/孔，細胞孵育箱中培養1 h后去棄去病毒液。將以上六組細胞置于37℃、5% CO2培養箱中培養，分別于感染早期（≤12 h）和感染晚期（≥48 h）收集細胞，依據試劑盒說明書操作，進行細胞凋亡檢測。實驗過程至少進行3次。

1.5 流式細胞術檢測細胞周期

將HELF細胞在96孔板中培養成單層細胞后，同步化培養12 h；約100 TCID50/孔病毒滴度感染細胞，于37℃、5% CO2培養箱中吸附1～2 h，棄上清；細胞對照組和病毒模型組更換維持液繼續培養；姜黃素各組終濃度分別為大劑量組（細胞維持液+HCMV+姜黃素0.8 μg/mL）、中劑量組（細胞維持液+HCMV+姜黃素0.4 μg/mL）和小劑量組（細胞維持液+HCMV+姜黃素0.2 μg/mL）；更昔洛韋組（細胞維持液+HCMV+GCV 50 μg/mL）。置于37℃、5% CO2培養箱中培養，分別于感染早期（≤12 h）和感染晚期（≥48 h）收集細胞。將收集的細胞制成單層細胞懸液，用預冷的PBS漂洗2次，1000 r/min離心5 min，加入預冷的70%乙醇，于4℃固定過夜后，PBS洗滌，離心后去除固定液，加PI染色液（含50 μg/mL PI、100 μg/mL RNase A、0.2% Triton X-100）置于4℃避光孵育30 min后即可進行細胞周期分析。實驗過程至少進行3次。

1.6 統計學方法

應用SPSS 21.0統計軟件處理數據，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t法和Dunnett-t法。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞凋亡情況比較

HCMV感染早期，病毒模型組與細胞對照組的細胞凋亡情況比較，差異無統計學意義（P > 0.05）；與病毒模型組比較，更昔洛韋組和姜黃素大、中、小劑量組細胞凋亡明顯增加（P < 0.05）。HCMV感染晚期，與細胞對照組比較，病毒模型組細胞凋亡明顯增加（P < 0.05）；與病毒模型組比較，姜黃素大、中、小劑量組細胞凋亡均有不同程度降低，其中姜黃素大劑量組與病毒模型組比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖1。

2.2 不同感染時期各組細胞周期情況比較

在HCMV感染早期及晚期，與細胞對照組比較，病毒模型組S期細胞顯著增多（P < 0.01）；與病毒模型組比較，姜黃素大、中、小劑量組S期細胞均明顯減少，而更昔洛韋組S期細胞明顯增多，G0/G1期細胞明顯減少（P < 0.05）。見圖2～3、表1。

3 討論

HCMV感染機體后，感染的細胞一般都處于不同的細胞周期。如果HCMV感染了處于G0/G1期的細胞，則細胞只能進入到G1/S期；如果HCMV感染了處于S期的細胞，則細胞會一直處于S期，表現為停滯狀態，最終導致細胞的有絲分裂停止[7]。本研究結果顯示在HCMV感染早期，病毒模型組S期細胞較細胞對照組明顯增多，而處于G0/G1期的細胞較細胞對照組有所減少。隨著感染時間延長，宿主細胞均表現為G2/M期細胞有所減少。經過姜黃素干預治療后，姜黃素各劑量組處于S期細胞均明顯少于病毒對照組，G0/G1期細胞均有所增多，細胞凋亡沒有增加。

HCMV感染機體后，機體細胞發生凋亡，細胞死亡后機體會清除這些細胞，這是機體抵抗病毒感染對機體造成損傷的一種機制。有研究發現在HCMV感染初期，HCMV為了阻止機體細胞凋亡，會轉錄表達某些蛋白以阻止細胞凋亡[8]，從而保證病毒復制增殖能夠順利進行，病毒的這種適應性為其持續感染創建了有利的環境。機體感染HCMV后，病毒可能是通過作用于一些調節細胞周期的細胞因子從而造成細胞正常周期的改變，比如感染后使細胞內細胞周期蛋白E（cyclin E）的表達上調，使細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）和周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKIs）活性均發生改變等[9]。有研究發現處于S期的二倍體纖維母細胞感染HCMV后細胞表現出周期停滯，并且還出現病理性有絲分裂[10]。Murphy等[11]的實驗結果與上述研究結果一致。Lunaldi等[12]研究證實抗HCMV抗體與內皮細胞激活和凋亡有關的分子基因程序的表達有關，可以促進熱休克蛋白60（HSP60）的釋放，這可能是抗HCMV抗體促凋亡的另一分子機制。黃晨等[13]研究發現，HCMV可以導致人臍靜脈血管內皮細胞增殖并且使宿主細胞處于G1期的細胞減少，進而推測HCMV感染可能促進了G0/Gl期細胞進入S期和G2/M期，細胞最終表現為增殖。有研究者發現HCMV感染后，抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯增多，運用更昔洛韋進行治療后，Bcl-2含量明顯減少，并且HCMV引起的抗凋作用明顯下降[14]。在HCMV病毒感染晚期，病毒對細胞凋亡的抑制作用解除，反而促進細胞發生凋亡，以便病毒釋放。細胞感染后HCMV可以潛伏于細胞中，造成免疫系統的長期激活，改變免疫狀態，從而引發機體產生多種慢性炎癥性疾病[15-16]。HCMV感染機體后患者會表現出視網膜炎，用更昔洛韋治療此類患者后，視網膜上皮細胞凋亡明顯受到抑制。Zhou等[17]發現，與感染前比較，感染HCMV的平滑肌細胞（SMCs）的增殖明顯提高。2005年，Reinhardt課題組[18]也得到了相同的實驗結果。有研究發現，HCMV感染SMCs后，細胞內p53的含量減少，SMCs的凋亡受到抑制[19]。同時Epstein等[20]也證實了這一點，即HCMV可以調控SMCs p53的基因表達，從而減少SMCs細胞的凋亡。Liao等[21]研究結果進一步表明HCMV感染可以影響內皮細胞和平滑肌細胞的自然凋亡過程。相關研究發現，姜黃素具有顯著抗HCMV的作用[22-23]，但具體機制不清。本研究發現姜黃素能夠對抗HCMV感染引起的細胞凋亡作用，可使HCMV感染早期誘導的抗凋亡作用和HCMV感染晚期誘導的促凋亡作用減弱。

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（收稿日期：2018-04-24 本文編輯：羅喬荔）