指標(biāo)正交試驗(yàn)法優(yōu)選雙桂祛寒顆粒揮發(fā)油提取工藝*

劉 寧，劉效栓，李喜香，李季文

1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2甘肅省中醫(yī)院藥學(xué)部

骨關(guān)節(jié)炎是患病率較高的慢性關(guān)節(jié)疾病，伴有不同程度的關(guān)節(jié)疼痛，功能障礙，以及由于關(guān)節(jié)軟骨的惡化及其他關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)參與而導(dǎo)致的生活質(zhì)量下降［1］。據(jù)估計(jì)，60歲以上的世界人口中約有十分之一的人有關(guān)節(jié)問題，大部分是骨關(guān)節(jié)炎造成的。作為最常見的肌肉骨骼疾病之一，骨關(guān)節(jié)炎是導(dǎo)致疼痛、殘疾和降低生活質(zhì)量的主要原因。近年來，隨著人口老齡化加劇，骨關(guān)節(jié)炎預(yù)計(jì)將成為未來的一個(gè)主要的衛(wèi)生保健問題，在60歲以上的人群中，癥狀性骨關(guān)節(jié)炎的患病率預(yù)計(jì)將在2030年達(dá)到30%［2］。盡管如此，西醫(yī)學(xué)的管理仍然主要是對(duì)癥治療(例如，對(duì)乙酰氨基酚，非甾體類抗炎藥和物理治療)，目前還沒有有效的藥理學(xué)策略來防止這種疾病的惡化［2-3］。與此同時(shí)，以中醫(yī)理論為指導(dǎo)的中成藥復(fù)方及以有效成分為主的天然藥物具有多環(huán)節(jié)、多層次、多靶點(diǎn)綜合作用的特點(diǎn)，其在改善生活量、緩解癥狀、降低致殘率等方面顯示出重要的臨床價(jià)值和獨(dú)特優(yōu)勢。雙桂祛寒方以傳統(tǒng)湯劑形式在我院臨床使用多年，由當(dāng)歸、肉桂、獨(dú)活等10味藥組成，具有溫腎祛寒止痛，逐風(fēng)活血通絡(luò)的功效，主要用于治療風(fēng)濕性、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，強(qiáng)直性脊柱炎，肩周炎，頸椎病等風(fēng)寒濕痹，以傳統(tǒng)湯劑形式在我院臨床使用多年。由于傳統(tǒng)湯劑在臨床應(yīng)用中有諸多不便，本實(shí)驗(yàn)組對(duì)其劑型改革，制備為顆粒劑。因本方中當(dāng)歸、肉桂、桂枝等5味藥材含有較多揮發(fā)油，并且有明顯的藥理作用，如當(dāng)歸揮發(fā)油具有抗血小板凝聚、神經(jīng)保護(hù)和鎮(zhèn)痛消炎等作用［4］；肉桂和桂枝中的桂皮醛有明顯的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用［5］。本實(shí)驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法制得揮發(fā)油，以揮發(fā)油得率和藁本內(nèi)酯及桂皮醛含量為指標(biāo)，應(yīng)用正交試驗(yàn)優(yōu)選其提取工藝，然后對(duì)確定的最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證，為雙桂祛寒顆粒的研制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(美國Waters公司2695型),717自動(dòng)進(jìn)樣器,2487雙通道紫外檢測器；FA1004電子分析天平(上海良平儀器儀表有限公司)；HWS-24電熱恒溫水浴鍋(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)、燒瓶、揮發(fā)油提取器、燒杯。

1.2 試藥及試劑 當(dāng)歸、肉桂等10味藥材由甘肅省中醫(yī)院提供，經(jīng)李喜香主任藥師鑒定為正品；藁本內(nèi)酯對(duì)照品(批號(hào)4431-01-0)、桂皮醛對(duì)照品(批號(hào)110710-201720)，購自中國食品藥品檢定研究院；乙醚(分析純)，購自利安隆博華(天津)醫(yī)藥化學(xué)有限公司；甲醇(色譜純)，購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無水硫酸鈉(分析純)購自天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油提取方法 按處方比例精密稱取肉桂、當(dāng)歸等5味藥材，共48 g，置圓底燒瓶中，加水，浸泡，用水蒸氣蒸餾法提取，于揮發(fā)油提取器中收集芳香水。

2.2 揮發(fā)油得率測定 將已制得的芳香水用乙醚萃取至水層無色，合并乙醚液，無水硫酸鈉脫水，室溫?fù)]散乙醚，稱重，計(jì)算揮發(fā)油得率。

2.3 含量測定方法

2.3.1 色譜條件 色譜柱：symmetryshield RPC18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長：327 nm(藁本內(nèi)酯)，290nm(桂皮醛)；柱溫：常溫；進(jìn)樣量20μL；流動(dòng)相：甲醇 - 水(65:35)；流速：1.0 mL/min。

2.3.2.1 對(duì)照品溶液的制備 藁本內(nèi)酯對(duì)照品適量，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，超聲至完全溶解，作為藁本內(nèi)酯對(duì)照品溶液(0.8 mg/mL)；另取桂皮醛對(duì)照品適量，精密量取，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，作為桂皮醛對(duì)照品溶液(0.0 2mL/mL)；最后精密吸取桂皮醛對(duì)照品溶液0.5 mL和藁本內(nèi)酯對(duì)照品溶液1 mL置10 mL量瓶，用甲醇定容，作為藁本內(nèi)酯、桂皮醛混合對(duì)照品溶液(藁本內(nèi)酯含量為0.08 mg/mL，桂皮醛含量為0.001 mL/mL)。

2.3.2.2 供試品溶液的制備 吸取已制得的揮發(fā)油樣品置于10mL容量瓶中，精密稱定，用甲醇溶解并定容，超聲(25KHz)處理30分鐘混勻后，放至室溫，微孔濾膜(0.22)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。2.3.2.3 陰性對(duì)照品溶液的制備 精密稱取不含藁本內(nèi)酯及桂皮醛的藥材樣品，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.3.3 方法學(xué)考察

2.3.3.1 專屬性試驗(yàn) 精密吸取藁本內(nèi)酯、桂皮醛混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液各10 μL，按上述色譜條件，雙波長同時(shí)測定，1=290 nm，2=327 nm；同時(shí)得到兩個(gè)不同波長的色譜圖。結(jié)果表明陰性對(duì)照無干擾，見圖1。

A1 藁本內(nèi)酯、桂皮醛混合對(duì)照品溶液（1表示290 nm)

A2 藁本內(nèi)酯、桂皮醛混合對(duì)照品溶液（2表示327 nm)

圖1 桂皮醛和藁本內(nèi)酯的HPLC

2.3.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取藁本內(nèi)酯、桂皮醛混合對(duì)照品溶液 5、10、20、30、40 uL，依次注入高效液相色譜儀，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測定，以進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：藁本內(nèi)酯回歸方程為：Y=2E+06X+123 102；R=0.999 1；桂皮醛回歸方程為：Y=8E+08X-96776；R=0.999 9；藁本內(nèi)酯和桂皮醛含量在分別在0.4～3.2 μg和0.005～0.04 μL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3.3 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取“2.3.2.1”項(xiàng)下藁本內(nèi)酯、桂皮醛對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，桂皮醛和藁本內(nèi)酯等色譜峰峰面積的RSD值分別為1.15%和1.03%，均小于1.5%，表明精密度良好。

2.3.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在 0、2、4、8、12、24 h進(jìn)行 HPLC 色譜分析。桂皮醛等色譜峰峰面積的RSD值分別為1.37%和1.32%，均小于1.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 平行稱取同一條件下得到的揮發(fā)油，按“2.3.2.2”項(xiàng)下方法制備供試液，以“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣6次，桂皮醛等色譜峰峰面積的RSD分別為1.42%和1.39%均小于1.5%，表明重復(fù)性良好。

現(xiàn)代社會(huì)開展“非遺”的生態(tài)化保護(hù)離不開科技創(chuàng)新。“非遺”的生態(tài)化傳承保護(hù)要堅(jiān)持與時(shí)俱進(jìn)，與社會(huì)科技發(fā)展同步，要積極運(yùn)用前沿的科學(xué)技術(shù)，維護(hù)“非遺”傳承保護(hù)的條件，解決傳承保護(hù)的短板，助推項(xiàng)目傳承人文化層級(jí)的提升。

2.3.3.6 加樣回收率測定 精密稱取已知桂皮醛(4.24 mL/g)和藁本內(nèi)酯(143.76 mg/g)的揮發(fā)油約0.1 g,平行取6份，分別加入桂皮醛0.424 mL和藁本內(nèi)酯14.37 mg,按照供試品溶液制備方法處理，進(jìn)樣，計(jì)算加樣回收率，桂皮醛的平均回收率為99.15%，RSD值為1.57%；藁本內(nèi)酯的平均回收率為99.13%，RSD值1.62%。

2.3.3.7 樣品含量測定 分別精密吸取9個(gè)供試品溶液各10 μL,注入高效液相色譜儀，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測定樣品中藁本內(nèi)酯和桂皮醛的含量。

2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.4.1 單因素試驗(yàn) 以浸泡時(shí)間、加水量、提取時(shí)間3個(gè)因素作為單因素考察對(duì)象，分別選取5個(gè)水平，按照以上提取方法提取揮發(fā)油，考察上述因素對(duì)揮發(fā)油提取率的影響。

2.4.1.1 浸泡時(shí)間的考察 按處方比例稱取肉桂、桂枝、當(dāng)歸等5味藥材，加12倍量水，分別浸泡 0、0.25、0.5、1、1.5 小時(shí)，水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油提取液，按“2.2”項(xiàng)下方法計(jì)算揮發(fā)油得率；揮發(fā)油得率分別為 0.211、0.323、0.405、0.398、0.245，故選擇0.25、0.5、1小時(shí)做為浸泡時(shí)間的考察因素。

2.4.1.2 加水量的考察 按處方比例稱取肉桂、桂枝、當(dāng)歸等 5 味藥材，分別加 6、8、10、12、14倍量水，浸泡0.5小時(shí)，水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油。按“2.2”項(xiàng)下方法計(jì)算揮發(fā)油得率；揮發(fā)油得率分別為 0.314、0.423、0.462、0.387、0.410，由于14倍水相較于12倍水揮發(fā)油得率并沒有顯著提高，故選擇8、10、12倍做為加水量的考察因素。

2.4.1.3 提取時(shí)間的考察 按處方比例稱取肉桂、桂枝、當(dāng)歸等5味藥材，加12倍量水，分別蒸餾提取 2、4、6、8、10 小時(shí)，收集揮發(fā)油提取液，按“2.2”項(xiàng)下方法計(jì)算揮發(fā)油得率；揮發(fā)油得率分別為 0.285、0.399、0.411、0.409、0.396。故選擇 4、6、8小時(shí)做為提取時(shí)間的考察因素。

2.4.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇浸泡時(shí)間(A)、加水量(B)、提取時(shí)間(C)、空白(D)為考察因素，選用L9(34)正交表，并根據(jù)每個(gè)因素的單因素考察結(jié)果選擇3個(gè)最佳單因素水平(見表1)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，按處方比例平行稱取9份當(dāng)歸、肉桂、桂枝、獨(dú)活、細(xì)辛藥材，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別測定揮發(fā)油得率并對(duì)相關(guān)指標(biāo)成分含量測定結(jié)果進(jìn)行綜合考察。(綜合評(píng)分揮發(fā)油得率、藁本內(nèi)酯含量、桂皮醛含量的權(quán)重系數(shù)分別為20、40、40；綜合評(píng)分=揮發(fā)油得率/最大揮發(fā)油得率×0.2×100+桂皮醛含量/最大桂皮醛含量×0.4×100+藁本內(nèi)酯含量/最大藁本內(nèi)酯含量×0.4×100)，因素水平表見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)表

表3 方差分析

從方差分析結(jié)果可以看出在所選水平因素范圍內(nèi)，各因素對(duì)揮發(fā)油含量的影響為B＞C＞A，即加水量＞提取時(shí)間＞浸泡時(shí)間，所以加水量對(duì)揮發(fā)油提取工藝有顯著影響，其次是提取時(shí)間，浸泡時(shí)間幾乎無影響。但為了讓其有效成分能充分提取并結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)情況，遂提取時(shí)間選中間值6小時(shí)，最終的結(jié)果為A1B3C2，即加12倍水(考慮到吸水量多加2倍水)，浸泡15分鐘，提取6小時(shí)(C為次要因素結(jié)合實(shí)際條件選擇6小時(shí))。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按處方比例擴(kuò)大8倍稱取肉桂、桂枝、當(dāng)歸等5味藥材(平行3份)，共384 g,加入12倍量的水，浸泡0.25小時(shí)，水蒸汽蒸餾提取6小時(shí)。收集揮發(fā)油，用乙醚萃取2次，合并乙醚萃取液，用無水硫酸鈉脫水，過濾，揮發(fā)至無乙醚味，計(jì)算揮發(fā)油得率，測定藁本內(nèi)酯、桂皮醛含量，計(jì)算RSD值。見表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

雙桂祛寒顆粒是根據(jù)古方傳統(tǒng)用法(湯劑)基礎(chǔ)上改制而成的，結(jié)合處方中各味藥的組成及與骨性關(guān)節(jié)炎藥理作用相關(guān)的有效成分的物理特性和作用特點(diǎn)還有實(shí)際情況，將提取工藝分為揮發(fā)油提取和水溶性物質(zhì)提取［6］，使各味藥中的有效成分能夠最大限度的提取，從而提高中藥利用率和臨床應(yīng)用療效。

該實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)方法［7-8］，采用多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)價(jià)正交試驗(yàn)法，使揮發(fā)油提取得率和有效成分結(jié)合，綜合考察各因素及水平對(duì)雙桂祛寒顆粒提取工藝的影響，在揮發(fā)油提取工藝優(yōu)選中，當(dāng)歸、獨(dú)活中所含的藁本內(nèi)酯及肉桂、桂枝中所含的桂皮醛為主要的揮發(fā)油成分［9-11］。因此，選擇其作為該工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)藁本內(nèi)酯和桂皮醛進(jìn)行HPLC含量測定，色譜條件為等度洗脫，使用全波長掃描測定，由于其兩種成分吸收強(qiáng)度差異較大，最終確定雙波長測定各成分，通過多次預(yù)實(shí)驗(yàn)后采用HPLC法對(duì)其成分的含量測定，最終所得兩者的峰形及分離度較好，陰性無干擾，方法可行。且驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明優(yōu)選的最佳提取工藝參數(shù)合理穩(wěn)定，且重現(xiàn)性良好，可用于實(shí)際生產(chǎn)。