食品微生物沙門菌的檢測

◎ 孫 蕾

（山東恒誠檢測科技有限公司，山東 萊州 261400）

1 檢驗沙門菌的原因

在食品中毒事件中，由細菌引發的疾病約占65%，而細菌中由沙門菌引起的食物中毒居于首位。資料顯示，在引起沙門菌中毒的食品中，肉類等動物性產品占到90%以上。因動物性產品中含有豐富的營養成分，非常利于沙門菌的生長繁殖，如果攝入含有大量沙門菌的動物性產品，就會引發細菌性感染，進而在毒素的作用下發生食物中毒。此外，沙門菌還有部分菌種在自然環境中發生變異，產生了類似耐藥性的海德堡沙門菌。

2 沙門菌的傳播媒介

2.1 肉及肉制品

據統計，肉及其制品中沙門菌檢出率：中國最高，為1.1%～39.5%；其次為美國，檢出率為20%～25%；第三為日本，檢出率為10.3%；第四為英國，檢出率為9.9%。

2.2 蛋及蛋制品

目前，國內蛋及其制品沙門菌檢出率為3.9%～43.7%，近年來由于蛋類污染造成細菌感染人數呈上升趨勢。

2.3 加工、運輸、銷售環境

在加工、運輸、出售過程中，食品也容易被沙門菌污染。因為，沙門菌在糞便、土壤、食品、水中可存活長達2年之久。

2.4 人為因素

人也可以作為沙門菌的傳染載體。例如，國外有個廚師感染了沙門菌后傳染了很多人。沙門菌是在人的病灶中生存，但是作為載體的人自己是沒有感覺的。另外，在恢復期的患者和無癥狀的帶菌者也可能成為常見的傳染源。

3 沙門菌感染的臨床表現

沙門菌感染主要表現形式有3種：胃腸型、傷寒型、敗血癥型。①胃腸炎型特點：起病急驟，伴有發熱癥狀，體溫一般在38～39 ℃，常伴有惡心、嘔吐，腹痛，腹瀉。②傷寒型特點：或有發熱癥狀，亦可有相對緩脈，常見腹瀉。③敗血癥型特點：多見于患有慢性疾病的成人、嬰幼兒、兒童等。起病急驟，有畏寒、發熱、出汗及輕重不等的胃腸道癥狀。

4 檢驗沙門菌的實驗室要求

檢驗沙門菌的實驗室要求是二級生物安全實驗室及二級生物安全柜（在負壓的情況下防止致病微生物的氣溶膠飄離實驗室對人員及環境造成污染）。

5 沙門菌的常規檢驗方法

沙門菌大小（0.6～1.0）μm×（2～3）μm，無芽孢，一般有鞭毛（雞沙門菌除外），無莢膜，多數有菌毛，革蘭氏陰性桿菌，需氧或兼性厭氧，最適生長溫度為35～37 ℃，最適pH值為6.8～7.8。目前，至少有67種O抗原和2 000個以上血清型，所致疾病稱沙門菌病。沙門菌常用生化檢測方法有三糖鐵（TSI），尿素酶試驗，吲哚試驗，VP試驗、賴氨酸脫羧酶試驗、丙二酸鹽試驗和ONPG試驗。

6 國內外沙門菌檢測方法對比。

國內常用檢測方法：國家標準、行業標準。

國外常見檢測方法：FDA（Food & Drug Administration），AOAC（Association of Official Analytical Chemists），FSIS（FOOD SAFETY AND INSPECTION SERVICE），ISO。

7 沙門菌的快速檢驗手段

目前，沙門菌的快速檢驗手段主要分為PCR技術和LAMP技術兩大類。①PCR技術中，熒光定量PCR技術靈敏度高、特異性好，是目前微生物檢測最精準的方法。但缺點是操作復雜，對所用儀器和操作人員要求高，不適合基層使用或現場快速診斷。②LAMP技術，即環介導等溫擴增反應，此方法的優點除了特異性高、靈敏度高之外，與PCR技術相比，操作簡單，對儀器設備要求低，結果呈現簡單，可通過肉眼觀察是否渾濁或熒光反應來進行判斷，簡單快捷，極其適合基層使用。下面著重就LAMP的一些情況作簡單說明。

7.1 LAMP技術的優缺點

LAMP方法的優點：操作簡單，只需將反應液、酶、引物和模板定量加入PCR管中；靈敏度高（比熒光PCR方法高2～5個數量級）；反應時間短（1 h內完成反應）；不需使用特殊儀器，通過肉眼觀察反應管是否變為白色渾濁就能判斷結果。

LAMP方法的缺點：密封不好，易形成氣溶膠污染，加之目前國內實驗室水平參差不齊，不能嚴格區分假陽性反應，建議在快檢試劑盒使用時采用實時渾濁儀；同時，對引物設計要求比較高，某些基因檢測并不適合該方法。

7.2 目前國內實驗室同類檢測設配使用情況

目前，國內基因診斷常采用PCR方法，涉及PCR儀，該儀器價格國產和進口價格不一，便宜的2萬～3萬也能買到，貴的20多萬。條件比較好的實驗室和國家機構也有采用熒光定量PCR方法的，但儀器價格較高，一臺熒光定量PCR儀的價格在20萬以上。

LAMP產品在臨床診斷中是不需要特殊儀器的，但臨床使用的成品試劑盒有賴于和國內擁有毒株的老師合作開發針對中國國情的疾病LAMP引物，在研發過程中由于涉及引物的選擇，引物濃度的調整，及反應溫度和時間的優化，需要用一種量化的方式去幫助研究者分析選擇數據，推薦使用實時基因擴增儀。

8 沙門菌的存活力

在潮濕的環境中，沙門菌的存活率更高，干燥環境中存活率低，但最近國外科學家研究發現細菌表面附著的生物膜會對沙門菌形成一種保護性外膜，這會對沙門菌存活起到保護作用，所以沙門菌的存活力比想象中更為強大，具有生物保護膜的沙門菌在干燥環境中存活力大為增強，之前認為在堅果、谷物、香料、奶粉和寵物食品等干性食品不可能存在該菌種的食品中也發現了沙門菌污染，它們能夠在長期存放環境中生存下來，所以要強調更好的衛生條件，研究更新的應對策略。

9 沙門菌檢測中需要注意的問題

沙門菌檢測國家標準為GB4789.4-2010《食品衛生學微生物檢驗 沙門菌檢驗》。

檢測中出現的主要問題為培養基和顯色瓊脂的選擇。沙門菌的種類比較多，為了防止漏檢，一般是強選擇性的培養基搭配選擇性弱一點的培養基，國標里面的TTB比SC選擇性要強，BS也比XLD的選擇性強；SC更適合傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌增菌，最適增菌溫度為36 ℃，TTB更適合其他沙門菌增菌，最適增菌溫度為42 ℃，因為沙門菌有2 000多個菌型，一種增菌液不可能適合所有的沙門菌生長，因此沙門菌增菌要同時用兩種培養基增菌。而沙門菌顯色培養基主要用于快速篩選、分離沙門菌。其基本原理：利用沙門菌特異性酶與顯色基團的特有反應，使色原游離出來，沙門菌在培養基上呈紫色或紫紅色，而大腸桿菌等其他腸道桿菌呈藍綠色。另外，增菌一般使用SC增菌液、SF增菌液（如果樣品是食品，那么還需要用BP增菌液進行預增菌）；分離培養一般使用SS瓊脂、XLD瓊脂、BS瓊脂、沙門菌顯色瓊脂等。