葡萄籽油超聲輔助提取優化及脂肪酸成分分析

◎ 段亮亮

（陜西中醫藥大學公共衛生學院，陜西 咸陽 712046）

隨著人們生活水平及品位的提高，葡萄酒工業迅速發展起來。葡萄籽為葡萄酒加工副產物，具有較大的開發價值，這主要由于葡萄籽中含有10%～20%的油脂[1]。葡萄籽油脂肪酸組成與大豆油相當，其中70%～90%的油脂為不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA），葡萄籽油由于較高的UFA含量，通常被用作高級保健油和營養油，用于肥胖、高血壓患者的輔助治療，及防止腦溢血等[2-3]。

超聲波輔助提取（Ultrasonic-assistant extraction，UAE），常用實驗室超聲波清洗儀進行，與其他提取方法相比較，如超臨界萃取和微波萃取。UAE存在許多優勢，如試驗設備操作方便，并且經濟[4]。UAE提取組織中有機物的原理是基于提取時間的延長，細胞壁周圍氣泡吸收超聲波的能量和熱量，導致破裂，破壞細胞的結構。一旦細胞結構破壞，有機溶劑將滲透到細胞里，超聲波穿過提取溶劑，促進細胞內有機成分的溶解和擴散[5]。這個過程中，有機物在提取劑里的溶解和擴散會受提取溶劑、提取時間、提取溫度和提取功率的影響。這些因素是影響UAE效率的重要因素。因此，本次研究的目的主要是優化超聲輔助提取各參數（提取溶劑、提取時間、提取溫度和提取功率），以高效提取葡萄籽油脂，并檢測其中的脂肪酸成分。

1 材料

1.1 試驗材料

釀酒葡萄赤霞珠（Cabernet Sauvignon）乙醇發酵后，皮渣中分離所得葡萄籽清洗3次，放入烘箱，在55 ℃條件下干燥，烘至含水量＜2%，粉碎至粒徑小于200目，備用。

1.2 試驗儀器及試劑

儀器：高速粉碎機HY-04A，北京環亞天元機械技術有限公司；電熱鼓風干燥箱DGG-101-3BS，天津市天宇實驗儀器有限公司；超聲波清洗器SG3200HBT，上海冠特超聲儀器有限公司；旋轉蒸發器RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠；水浴鍋XMT-DA，余桃市亞星儀器儀表有限公司；多功能氮吹儀TTL-DC，北京同泰聯科技發展有限公司；6890NGC/5975BMS氣相色譜與質譜聯用儀，美國安杰倫公司。試劑：除甲醇和脂肪酸甲酯化衍生后提取溶劑己烷為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 超聲波輔助提取赤霞珠果籽油

稱量10 g樣品于200 mL錐形瓶中，加入提取溶劑正己烷，鋁箔封口，放至超聲波儀中在設定條件下進行提取。提取完成后，真空旋轉蒸發至溶劑基本揮發完，放入55 ℃的烘箱中烘干至恒重，并精確記錄質量，重復3次，取均值。

果籽油提取率計算：提取率（%）=m1/m2×100%。式中：m1為葡萄籽油質量，g；m2為葡萄籽粉質量，g。

2.2 脂肪酸成分

10 mg葡萄籽油提取物中加入3 mL 1% H2SO4-CH3OH衍生化試劑，65 ℃條件下水浴衍生化2 h。加入2 mL己烷振搖30 s，加入5 mL蒸餾水分層萃取，選取上層溶液，萃取3次，無水Na2SO4過濾除水[6]。99.999%高純氮吹至1 mL，0.45 μm濾膜過濾，進樣分析脂肪酸成分。

2.3 GC-MS分析條件

毛細管柱型號：Agilent 19091N-136，HP-INNOWAX Polyethylene Glycol 60 m×0.25 mm ×0.25 μm（J&W scientific，USA）。采用程序升溫：初溫80 ℃，保持1 min，然后以25 ℃/min的速度升溫至220 ℃，再以5 ℃/min的速度升溫至250℃，保持20 min。不分流進樣，進樣量1 μL，載氣99.999% He，流速1 mL/min。進樣口溫度：250 ℃。進樣口壓力：93.49 kPa。吹掃流量：55.9 mL/min。吹掃時間：0.75 min。總流量：63.9 mL/min。

質譜條件：質譜接口溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，四級桿溫度150 ℃，電離方式EI，離子源能量70 eV，質量掃描范圍為20～350 u。

定性和定量：結合各標準物質特征離子和出峰時間，采用NIST08譜庫進行檢索匹配定性，采用內標法進行定量，內標十九酸甲酯，濃度0.4 mg/mL。

2.4 數據分析與作圖

采用SPASS 13.0數據處理軟件對實驗數據進行分析，Origin 8.0軟件進行作圖。

3 結果與分析

以葡萄果籽油提取率為考察指標，分析超聲時間、料液比、超聲功率、超聲溫度四個因素對葡萄籽中脂肪酸提取量的影響，確定最佳提取條件。

3.1 超聲時間對葡萄籽油提取量的影響

準確稱取6份水分含量＜2%的葡萄籽粉10 g，置于錐形瓶中，加入正己烷60 mL，用封口膜封口，放入超聲波提取儀中，在28 ℃、264 W條件下，分別超聲10、20、30、40、50、60 min，收集提取液，真空旋轉蒸發至有機溶劑揮發完，55 ℃的烘箱中烘干至恒重，測定油脂提取率，重復3次，確定最佳超聲時間。

由圖1可知，提取時間小于30 min時，葡萄果籽油提取率隨著時間的延長明顯增大；當提取時間大于30 min時，油脂提取率趨于平緩，變化不顯著，表明30 min后，隨提取時間的延長對油脂提取率的影響不大，因此，超聲提取時間最佳為30 min。

圖1 超聲時間對葡萄籽油提取率的影響圖

3.2 超聲功率對葡萄果籽油提取率的影響

樣品中加入60 mL正己烷，在超聲功率176、220、264、308、352、396 W條件下，28 ℃超聲提取30 min，測定油脂提取率，重復3次，確定最佳超聲功率。

由圖2可知，超聲功率設定在176～352 W時，隨著功率的增大，超聲波對細胞壁的破碎作用增強，胞內油脂溶出速率增大，溶液中葡萄籽油提取率也逐漸增大；在352～396 W時，隨著超聲功率的增大，油脂提取率沒有明顯變化。因此，超聲波提取功率最佳為352 W。

圖2 超聲功率對葡萄籽油提取率的影響圖

3.3 料液比對葡萄果籽油提取率的影響

分別加入料液比為1∶4、1∶6、1 ∶8、1 ∶10、1∶12、1∶14的正己烷，在超聲功率352 W，超聲溫度28 ℃的條件下，超聲提取30 min，測定葡萄籽油提取率，重復3次，確定最佳料液比。

由圖3可知，料液比小于1∶8時，葡萄果籽油提取率隨著料液比的增大明顯增大；當料液比大于1∶8時，油脂提取率趨于平緩，沒有明顯的增大，表明料液比1∶8時能夠實現葡萄籽油的充分提取。因此，料液比最佳為1∶8。

圖3 料液比對葡萄籽油提取率的影響圖

3.4 超聲溫度對葡萄果籽油提取率的影響

葡萄籽樣品按照料液比為1∶8的比例加入正己烷，分別在20、28、36、44、52、60 ℃，352 W條件下超聲提取30 min，測定葡萄籽油提取率，重復3次，確定最佳超聲溫度。

由圖4可知，不同超聲溫度對葡萄籽油提取率具有一定影響，隨著溫度升高，提取率提高，當溫度達到44 ℃后，葡萄籽油提取率沒有明顯增加，開始趨于平緩。這可能是因為油脂提取已趨于飽和，所以不再會隨溫度升高而增多。因此，44 ℃為最佳提取溫度。

圖4 超聲溫度對葡萄籽油提取率的影響圖

3.5 葡萄籽油提取正交試驗

結合單因素實驗的結果，選取超聲時間、超聲功率、料液比、提取溫度4個因素，每個因素4個水平，按L16（44）設計進行正交試驗，因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表

由表2極差分析結果表明，影響葡萄籽油提取率的因素主次順序是料液比＞超聲時間＞超聲功率＞超聲溫度。從表3方差分析結果來看，料液比對葡萄籽中脂肪酸提取含量影響最為顯著。由極差和方差分析綜合得出，超聲提取葡萄籽中脂肪酸的最佳工藝條件是A3B1C4D4，即超聲時間為35 min，超聲功率308 W，料液比為1∶8，超聲溫度為52 ℃。

表2 超聲提取工藝正交試驗結果表

表3 試驗方差分析表

按上述最佳提取條件，進行3次平行實驗，葡萄籽油得率分別為11.01%、11.07%、11.03%，平均值為11.04%，穩定性較好，說明正交試驗結果正確可靠。每個樣品重復提取3次，取其平均值得出赤霞珠葡萄籽油提取率為11.46%。

3.6 赤霞珠葡萄籽油脂肪酸分析

采用GC-MS對超聲輔助提取最佳工藝條件下所得的葡萄籽油的脂肪酸組成與含量進行了測定。如圖5所示，共檢測出10種脂肪酸成分，其中以亞油酸（80.843%）、棕櫚酸（7.283%）、油酸（8.057%）、硬脂酸（3.260%）為主，其次為亞麻酸（0.284%）、二十酸（0.150%）、十七酸（0.050%）、十四酸（0.044%）、棕櫚油酸（0.027%）、十五酸（0.002%），該研究結果與以往研究基本一致[7]。

圖5 葡萄籽油中定量脂肪酸含量圖（mg/kg）

4 結語

超聲提取葡萄籽中脂肪酸酯的最佳工藝條件是超聲時間35 min，超聲功率308 W，料液比為1∶8，超聲溫度為52 ℃，該條件下葡萄籽油提取率為11.46%，葡萄籽油中檢出脂肪酸成分10種，主要成分為亞油酸、軟脂酸、油酸、硬脂酸。

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