諾如病毒的最新研究進展

◎ 仉 薇，吳 鑫，章志超

（江西省食品檢驗檢測研究院，江西 南昌 330001）

諾如病毒是全球急性胃腸炎流行和散發病例最常見的原因，也是食源性胃腸炎的主要原因[1-2]。諾如病毒的感染性很強，很少的病毒量（小于100個病毒顆粒）即可造成感染，直接通過糞-口途徑傳播，除了導致幼兒、免疫功能低下患者和老年人的高感染率、高死亡率外，還造成巨大的經濟損失[3]。據統計，僅在美國就有2 100萬例病例，每年有70 000例住院和800例死亡[4]，我國2006—2013年全國諾如病毒腹瀉疫情報告數也逐年上升，共報告56起，發病4 979例，平均每起89例病例[5]。其暴發通常與貝類或新鮮制備的蔬菜、水果沙拉有關，一般是由于感染的糞便污染了水或者源于感染的食品處理者[6]。

1 諾如病毒的結構及多樣性

諾如病毒以前被稱為諾瓦克樣病毒，1972年美國學者Kapikian首先用免疫電鏡技術從胃腸炎患者的糞便樣本中檢出了該病毒，并且正式定名為諾如病毒[7]。諾如病毒屬于杯狀病毒科，諾如病毒屬，直徑通常在27～37 nm，無囊膜。是基因組長度在7.5～7.7 kb左右的單鏈RNA病毒，有3個開放閱讀框，ORF-1長約5 kb，ORF-2長約1.8 kb，ORF-3長約0.6 kb，分別編碼非結構多聚蛋白，主要結構蛋白VP1和強堿性微小結構蛋白[8]。依據其基因特征，主要分為6個基因型GⅠ-GⅥ，每個基因型又包含不同的基因亞型，其中GⅡ.4型占全世界流行的諾如病毒的70%～80%，主要引發人感染病毒性胃腸炎。諾如病毒易變異，單個病毒株之間的差異高達2.8%，基本每隔兩三年便會出現新的變異株，從而引發局部大的暴發流行。

2 諾如病毒的流行病學和暴發

目前，諾如病毒在全世界均廣泛流行，1995—2000年，85%以上的暴發性病毒性胃腸炎系諾如病毒所致[9]。美國疾病控制和預防中心估計，美國每年有60%的急性胃腸炎是由諾如病毒感染引起的。我國在山西、北京、安徽、福州、武漢、廣州、廣西等地也先后發生諾如病毒感染性腹瀉疫情[10]。人類是人諾如病毒的唯一宿主，人群普遍易感，諾如病毒在不同年齡段均可造成感染，且諾如病毒感染在各種環境中均有報道，特別是生活區密集、共用餐飲設施和環境維護困難的地方（如養老院、學校、醫院、軍隊等）。諾如病毒最主要的傳播途徑是糞-口途徑，可通過被污染的食物或水引起人群胃腸炎散發甚至暴發。目前，估計由食物引起的諾如病毒感染胃腸炎可占50%。其中，牡蠣等貝類是最常見的引發諾如病毒感染的食物，由于牡蠣可以捕獲和富集大量諾如病毒顆粒，并且人們常常生食牡蠣，人吃了帶有大量諾如病毒的牡蠣，就有可能感染諾如病毒，如果此時在一個較為封閉的環境中就很有可能造成諾如病毒感染性胃腸炎，因而對于牡蠣中諾如病毒的快速檢測是非常有意義的[11]。

3 諾如病毒的臨床特點

諾如病毒的潛伏期在12～72 h，感染者表現為突然發病，主要癥狀為嘔吐和腹瀉，有些還伴有腹痛和發熱，平均癥狀持續時間在1.2～2.8 d[12]，在1～3 d有86.4%的患者癥狀消失，嚴重程度和年齡、是否患有合并癥以及免疫功能有一定關聯。諾如病毒感染還可表現為無癥狀感染，可在攜帶者糞便中檢測到諾如病毒，但是攜帶者卻沒有表現出常見的感染癥狀，這種情況在兒童中最為常見。諾如病毒的無癥狀排泄具有診斷意義，無癥狀攜帶者可以造成諾如病毒的散播，同時需要注意無癥狀攜帶者因其他原因引起的腹瀉被誤診為諾如病毒感染[13]。

4 諾如病毒的體外培養

在過去的40多年中，人們嘗試在支持多種病毒生長的實驗室培養物（如源自癌變組織的轉化細胞）以及轉化的腸上皮細胞及原代人類免疫細胞中培養人諾如病毒，但是均以失敗告終[14-15]。此外，諾如病毒是有物種特異性的，人諾如病毒只感染人類并導致人類患病，人諾如病毒并不在小鼠或其他小型模式動物體內繁殖擴增，這極大地限制了諾如病毒疫苗的研究。直到2016年，Khalil Ettayebi的團隊成功在源自人干細胞的類腸道組織培養物中培養了人諾如病毒，實現了諾如病毒的體外培養，并且揭示了有些人諾如病毒的復制依賴膽汁的存在，不同的人諾如病毒在不同腸段的腸上皮細胞復制。這一新的培養體系的建立，能夠幫助人們更進一步深入研究諾如病毒的進化、免疫及發病機制，并且有望用于促進食品安全，以及新疫苗的研發等[16]。

5 諾如病毒的檢測

我國是水產品的養殖大國，也是水產品的出口和消費大國。近年來，隨著世界各國對食品安全的重視，我國水產品出口屢屢遭受技術壁壘，美國和日本、歐盟等許多國家和地區對我國的水產品提出了諸多嚴格的限量指標，其中一項規定是諾如病毒不得檢出[17]。諾如病毒在環境中生存能力強，感染劑量小，可以通過多種途徑傳播，因而對于其檢測技術要求較高。目前，主要的檢測方法有電鏡法、免疫學檢測和分子生物學檢測方法。

5.1 電鏡法

電鏡法分為直接電鏡法和免疫電鏡法。在國內，方肇寅等首次用直接電鏡法發現了腹瀉病人大便樣品中的諾如病毒[18]。美國學者Kapikian在1972年用免疫電鏡法首次觀察到美國諾瓦克鎮腹瀉患者糞便中的諾如病毒[7]。電鏡法是諾如病毒檢測的經典方法，但是該方法的缺陷明顯，諾如病毒在電鏡下的形態并不明顯，判斷依賴于檢測者的經驗，靈敏度較低，并且操作繁雜，需要專業人員操作，設備昂貴，無法廣泛普及，不適于臨床研究及大規模的普查。

5.2 免疫學檢測法

免疫學方法主要包括放射免疫法、生物素-親和素免疫法和酶聯免疫法。近年來，利用原核或真核表達系統表達諾如病毒蛋白從而建立快速檢測方法不斷涌現。免疫法的特點是操作簡便，耗時較少，但是其靈敏度不高。

5.3 分子生物學檢測法

分子生物學方法包括常規PCR、巢氏PCR、熒光定量PCR等。熒光定量PCR現已成為諾如病毒診斷的金標準，廣泛應用于諾如病毒的檢測。但是，由于諾如病毒的多樣性，要設計出一對通用引物是該方法的難點；并且，由于熒光定量PCR系統的開放性，很容易發生交叉污染，造成假陽性，對診斷造成干擾。隨著分子診斷技術的發展和應用，多重熒光定量PCR能同時診斷多種腸道病毒如諾如病毒、星狀病毒和輪狀病毒。該方法能用于低濃度的諾如病毒檢測，還能夠進一步對病毒進行分型，對諾如病毒流行病學的研究有重要意義[19]。

6 諾如病毒的預防與治療

若人們食用了被諾如病毒污染的食物，則易于引起諾如病毒的感染甚至暴發。以最常見的牡蠣為例，由于受污染的牡蠣暴發呈現不同的季節性，因而可以提前做好檢測工作，從而防患于未然，防止因食用牡蠣導致諾如病毒的暴發。另外，針對封閉或半封閉的環境，加強環境衛生管理以及增強個人衛生意識是非常重要的[20]。

人諾如病毒感染一般具有自限性，因而臨床治療以對癥治療和支持療法為主，治療的關鍵在于針對腹瀉和脫水的補液治療，病情嚴重的患者還需要糾正酸中毒和電解質代謝異常。由于還沒有特效的抗病毒藥物和疫苗，在這兩個領域也是涌現許多新成果。隨著越來越多諾如病毒蛋白結構的解析，通過計算機模擬設計靶向的抗病毒藥物成為可能。研究發現，不同毒株的諾如病毒存在許多相似的保守結構，通過對這些保守結構的進一步探索，可能產生有效對抗諾如病毒毒株多樣性的抑制劑。迄今為止，已經測試了主要靶向病毒蛋白的大量候選抑制劑，但是其活性通常較低，不能達到預期效果[21]。而在諾如病毒疫苗研究方面，主要焦點在于如何構建能夠刺激機體產生較好免疫反應、耐熱、耐酸的病毒樣顆粒。全球多個實驗室已經開展了諾如病毒樣顆粒疫苗及亞單位疫苗的臨床前研究及臨床試驗。

7 展望

諾如病毒在全球范圍造成了較重的經濟負擔，雖然人們在抗病毒藥物和疫苗的研發方面做了許多積極的嘗試，但是目前為止仍然沒有一種藥物用于預防諾如病毒的感染或臨床治療。這與針對腸道病原體的所有抑制劑一樣，與抑制劑能否被準確地遞送至復制點并且能夠在腸道環境中穩定發揮效用有關。除了在抗病毒藥物和疫苗方面仍需繼續探索外，諾如病毒細胞培養系統的建立及人諾如病毒動物模型的構建也是今后發展的重點。這兩個系統的完善能夠幫助人們進一步認識諾如病毒的特性，并且能夠給治療藥物的研發提供試驗條件。在此之前，采取有效的檢疫和衛生預防措施仍舊是控制諾如病毒感染的最好選擇。

[1]Glass RI，Parashar UD，Estes MK. Norovirus Gastroenteritis[J].New England Journal of Medicine，2009，361（18）：1776-1785.

[2]Ramani S，Atmar RL，Estes MK. Epidemiology of human noroviruses and updates on vaccine development[J].Current Opinion in Gastroenterology，2014，30（1）：25-33.

[3]Green KY. Norovirus infection in immunocompromised hosts[J].Clinical Microbiology & Infection，2014，20（8）：717.

[4]Lopman B，Gasta?aduy P，Park GW，et al.Environmental transmission of norovirus gastroenteritis[J].Current Opinion in Virology，2012，2（1）：96-102.

[5]張 靜，常昭瑞，孫軍玲，等.我國諾如病毒感染性腹瀉流行現狀及防制措施建議[J].疾病監測，2014，29（7）：516-521.

[6]Kendall ME，Mody RK，Mahon BE，et al.Emergence of salsa and guacamole as frequent vehicles of foodborne disease outbreaks in the United States, 1973-2008[J].Foodborne Pathogens& Disease，2013，10（4）：316-322.

[7]Kapikian AZ，Wyatt RG，Dolin R，et al.Visualization by Immune Electron Microscopy of a 27-nm Particle Associated with Acute Infectious Nonbacterial Gastroenteritis[J].Journal of Virology，1972，10（5）：1075-1081.

[8]Thorne LG，Goodfellow IG. Norovirus gene expression and replication[J].Journal of General Virology，2014，95（2）：278-291.

[9]Lopman BA，Reacher MH，Van DY，et al. Viral gastroenteritis outbreaks in Europe, 1995-2000[J].Emerging Infectious Diseases，2003，9（1）：90-96.

[10]韋志光，江世平，張 屹，等.2007年某高校諾如病毒引起感染性腹瀉暴發疫情分析[J].應用預防醫學，2007，13（4）：213-215.

[11]Wang J，Deng Z. Detection and forecasting of oyster norovirus outbreaks: Recent advances and future perspectives[J].Marine Environmental Research，2012，80（80）：62-69.

[12]Lee RM，Lessler J，Lee RA，et al.Incubation periods of viral gastroenteritis: a systematic review[J].Bmc Infectious Diseases，2013，13（1）：446.

[13]Schwartz M，Gluck M，Koon S. Norovirus Gastroenteritis After Fecal Microbiota Transplantation for Treatment of Clostridium difficile Infection Despite Asymptomatic Donors and Lack of Sick Contacts[J].American Journal of Gastroenterology，2013，108（8）：1367.

[14]Duizer E，Schwab KJ，Neill FH，et al.Laboratory efforts to cultivate noroviruses[J].Journal of General Virology，2004，85（1）：79.

[15]Lay MK，Atmar RL，Guix S，et al. Norwalk virus does not replicate in human macrophages or dendritic cells derived from the peripheral blood of susceptible humans[J].Virology，2010，406（1）：1.

[16]Ettayebi K，Crawford SE，Murakami K，et al.Replication of human noroviruses in stem cellderived human enteroids[J].Science，2016，353（6306）：1387-1393.

[17]蘇來金，柳淑芳，李 振，等.水產品中諾如病毒富集方法的優化研究[J].漁業科學進展，2008，29（6）：126-132.

[18]方肇寅，溫樂英，晉圣瑾，等.在我國腹瀉患兒中發現諾瓦克樣病霉感染[J].病毒學報，1995（3）：215-219.

[19]沈家瑜，徐德順，韓建康.諾如病毒檢測技術研究應用進展[J].中國衛生檢驗雜志，2014（13）：1974-1976.

[20]Lee MB，Greig JD. A review of nosocomial norovirus outbreaks: infection control interventions found effective[J].Epidemiology &Infection，2012，140（7）：1151-1160.

[21]Armando A，Edward E，Surender V，et al. Progress towards the prevention and treatment of norovirus infections[J].Future Microbiology，2013，8（11）：1475-1487.