三維培養下應力對間充質干細胞分化的影響研究進展

張旭林，徐永清，毛羽馳,何曉清，劉 帥

作者單位：650032昆明，昆明醫科大學研究生部（張旭林，毛羽馳，劉 帥）；解放軍920醫院骨科（張旭林，徐永清，何曉清，劉 帥）

在骨科臨床實踐中，伊利扎諾夫技術（Ilizarov）解決了許多令醫生們頭疼的疑難雜癥，其治療適應證也在基礎研究的帶領下不斷拓寬，如糖尿病足、腦中風、脊柱側彎等。而該技術的核心“張力-應力法則”，則進一步將應力與細胞分化聯系在一起。但該技術目前最大的阻礙是長時間佩戴給患者帶來的不便及引起的各種臨床并發癥[1]。隨著伊利扎諾夫技術的推廣，尋求縮短治療時間和減少并發癥的方法顯得極為重要。而三維細胞培養可能是解決上述問題的有效措施的基礎之一，因此，筆者對三維培養下應力對間充質干細胞分化的相關研究進行綜述。

1 三維培養對應力下間充質干細胞(MSCs)分化研究的優勢

MSCs是一種具有多向分化潛能，來源于中胚層和神經外胚層，并且不表達造血系相關標志的成體多能干細胞[2]。根據來源可以分為骨髓間充質干細胞、臍帶間充質干細胞、滑膜間充質干細胞等。目前相關文獻均認為身體的各部分間充質內均含有MSCs，而且其比成體干細胞有更大的分化潛能，同時也減少了倫理審查的要求，所以，MSCs從發現之初便被寄予厚望[3-4]。但在諸如實驗室普通細胞瓶等二維培養環境下，MSCs分化率低。而立體培養技術相對而言，更能模擬身體內細胞的生理環境，有利于細胞的基因表達和信號傳導，更有利于模擬牽拉成骨過程中應力對MSCs分化的影響，進而研究提高牽拉成骨效率的方法。

1.1 三維培養下細胞聯系密切 二維細胞培養技術是近代生物醫學發展的基礎，但是，以這種模式所建立的細胞模型與細胞實際所處的生長環境有差異，不能像體內一樣進行信號通路和內分泌傳導。而三維培養作為一種更接近于機體生理環境的細胞培養方式，它更能給細胞提供生長和信息傳遞所需的仿生環境。基于此特點，在腫瘤、干細胞、組織工程等領域中，三維細胞培養的應用價值更為突出。Hanahan等[5]研究表明，三維培養下更能觀察到腫瘤獨特的性質，包括獨特的生長信號、永生性、無限復制、失控的血管增殖、組織侵襲、躲避免疫攻擊、促進腫瘤的炎癥等特性。所以，不斷有研究者利用三維培養來論證其優勢。Wang等[6]用三維培養來研究前列腺癌，證實了細胞與三維支架所形成的結構對細胞的分化和表型均有幫助；Kim等[7]通過乳腺癌細胞實驗表明，三維細胞培養可以實現在同一體系中培養不同表型的腫瘤細胞，比傳統細胞培養更準確地模擬腫瘤組織的結構和分化。

三維細胞培養類型根據外力施加的有無分為靜止三維培養和動力三維培養，其中由于靜止三維培養過程中重力是唯一的力學影響因素，而本綜述涉及的是外界應力，所以，本研究只討論動力三維培養。在胚胎發育過程中，細胞間不僅通過自分泌和旁分泌調節增殖和分化，也通過應力的變化產生聯系。臨床應用中Ilizarov技術就是一個很好的例子，通過緩慢牽拉組織來使某些組織獲得再生。Leucht等[8]的研究表明，應力通過細胞外基質傳遞到細胞，而應力對細胞的刺激可以改變細胞內部應力的分布，使細胞發生變形，通過細胞膜上信號受體與周圍細胞發生聯系。中外學者針對應力對細胞內部的影響做了很多研究，戚孟春等[9]對MSCs施加高應力，然后觀察到細胞骨架F-actin（細胞框架的主要成分）解聚和重排的現象，不僅說明了高應力對細胞骨架的破壞，而且說明細胞骨架是應力的傳導途徑。此外，在細胞應力與細胞內聯系的研究中，學者們發現整合素、第二信使系統、應力反應原件（一種受應力影響的順式調控原件）都是應力與細胞溝通的重要組成部分[10-12]。而在這個連接通路上，細胞外基質、整合素和細胞骨架所構成的系統把應力從力學信號轉變為化學信號起了極其重要的作用。而陳晨等[13]認為，局部黏附蛋白也參與構建了這個系統。而三維培養在生物支架的幫助下，可以使細胞間形成上述的“應力傳遞系統”。

1.2 三維培養下細胞所受應力 目前，三維細胞培養使用的方法有：細胞團培養、基質覆蓋培養、旋轉燒瓶培養、旋轉細胞培養系統、微載體培養、微囊化培養等[14]，這幾種方法給細胞所提供的力學因素有利于促進其增殖分化和形成外基質。能對細胞產生影響的應力目前主要包括微重力、剪切力、張力和壓力，在MSCs分化方面，流體靜壓也可以促進其向軟骨分化。三維培養中能穩定提供的是微重力（旋轉生物反應器可以模擬微重力失重狀態）和剪切力，而提供的流體剪切力不僅不會引起細胞破損，而且還有利于細胞成骨化[15]。但由于這些培養系統所產生的應力不能方便廉價的提供張力和壓力，使外界牽拉力很難應用與細胞培養中。水凝膠基質材料常規都是單純的彈性材料，不能施加應力，但哈佛的Ovijit等改良了普通的三維水凝膠培養法，其制作的有快速應力松弛性質的水凝膠能夠產生的彈性模量為17 kPa，能夠誘導MSCs形成天然骨基質。這種方法不僅簡化了額外應力的供應，而且還促進MSCs增殖分化[16]，最重要的是水凝膠本來就是三維培養中的骨架材料。

2 應力對MSCs分化的影響

生理狀態下，受機體運動及重力的影響，體內細胞的行為與張力、壓力、剪切力、重力等應力有著密切的關系，這些應力可能會對機體的生長發育產生重要的影響。

2.1 應力大小與細胞分化 在體外培養過程中發現，外界應力刺激，會對細胞生長產生影響。劉天一等[17]通過用每天2次、每次0.5 h的離心力來處理骨髓MSCs，經1～2個月后觀察發現，使用應力的實驗組產生了更多的蛋白聚糖，說明MSCs在足夠應力的刺激下產生了分化。Chaudhuri等[16]通過控制藻酸鹽水凝膠的納米級結構來調節水凝膠的的應力松弛性能，從而模擬活組織的粘彈行為來進行間充質細胞的培養，實驗發現不同的彈性模量會影響干細胞分化的方向，當彈性模量在10 kPa以內時，其主要向脂肪細胞分化；而彈性模量升高到11～30 kPa時，其會向成骨細胞分化；同時在9 kPa和17 kPa時，向脂肪細胞分化的能力降低甚至不分化。Li等[18]通過先使用軟骨誘導培養基來對大鼠的MSCs進行前期培養，再對其施加液態靜壓力和大小為13～36 kPa、頻率為0.25 Hz的動態液體壓，結果發現Ⅱ型膠原纖維α1和聚集蛋白聚糖的基因表達增加，同時硫酸化糖胺聚糖發生富集，說明在應力的作用下，細胞產生了相應的應答，趨向于軟骨分化。

2.2 應力類型與細胞分化 在應力（張力、剪切力、滲透壓及微重力）的來源中，滲透壓所產生的應力是一個特殊的類型。在機體生理條件下，關節軟骨受到的滲透壓為350～450 mOsm。Caron等[19]通過研究發現，可以通過提高軟骨細胞分化培養基的滲透壓來增加MSCs Sox9、Col2α1、aggreca基因的表達。Lu等[20]通過對MSCs施加可調控的流體剪切力，發現不同的剪切力會影響MSCs向成骨或軟骨細胞的分化。Alves等[21]用三維培養模式動態灌注的方法，模仿生理條件下關節所受的剪切力，作者將MSCs接種于纖維支架上，實驗組放于灌注式生物反應器內培養。實驗結果顯示含剪切力的實驗組MSCs發生了分化。霍建忠等[22]應用三維細胞培養技術，旋轉培養系統以20 r/min的轉速培養兔MSCs，發現三維應力組的軟骨特異性基質和Ⅱ型膠原酶的mRNA的表達明顯高于對照組。上述研究表明，應力（張力、剪切力、滲透壓及微重力）對MSCs的生長、增殖及分化會產生重要的影響，尤其是在三維培養下，細胞應力的傳遞系統更完整，對MSCs分化的促進作用更明顯，但應力對MSCs分化方向的影響機制尚未研究清楚。

3 未來與展望

目前，以牽拉成骨為代表的Ilizarov技術以其神奇的功效，不斷拓寬其應用領域。但治療周期長、釘道感染、外固定架調整、影響生活等問題難以解決。對于這些問題，不斷有學者探索解決的方法，倪明等[23]通過在牽拉成骨動物模型中注入富血小板血漿及脫鈣骨基質，探索采用外界干預來縮短牽拉成骨時間的方法。對這類問題的探究或許可以改變很多疑難雜癥的治療方案。而三維培養下研究應力與MSCs分化的關系，可以為解決這類問題提供基礎。