免疫性血小板減少癥患者 CD19+CD24highCD27+及CD24highCD27+CD38highB調節細胞的表達

費菊萍，壽黎紅，董曉輝，曹丹，方遒，徐偉來，韋菊英，劉輝

B調節細胞（Breg）是一組誘導免疫耐受的免疫抑制細胞，其通過產生白介素10、白介素35、轉化生長因子b（TGF-b）等細胞因子抑制病理性T細胞及其他炎癥前淋巴細胞的擴增，從而抑制病理性的免疫過程。不同的炎癥環境誘導產生不同的Breg細胞，目前人體中已鑒定出 CD24highCD27+[1]、CD19+CD24highCD27int[2]、CD19+CD24highCD38high[3]、CD19+CD25highCD71high[4-5]等多種Breg細胞，在感染、結締組織病等中具有重要作用。為了研究 Breg細胞在免疫性血小板減少癥（ITP）中的作用，筆者檢測了 CDl9+CD24highCD27+細胞及 CD24highCD27+CD38high細胞在ITP患者外周血中的數量，以探討Breg細胞在ITP中的作用。報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料 收集2015年7月至2017年12月浙江省湖州市中心醫院和浙江大學醫學院附屬第一醫院收治的ITP患者80例，其中男33例，女47例；年齡16～80歲，中位年齡41歲。診斷和分期標準按成人原發免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識（2016年版）[6]。對照組為45例本院同期健康志愿者。

1.2主要試劑 CD19 FITC、CD27 APC及CD24 PE單抗均購自美國BD公司，CD38PE-CY7單抗購自美國beckman coulter公司。

1.3方法 取外周血標本 2 m l，用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，采用流式細胞儀（FACS）檢測表型為CD19+CD24highCD27+及 CD24highCD27+CD38high細胞。檢測步驟：（1）取適量CD19、CD24、CD27 和CD38單抗，加入上樣管中和100l外周血，輕輕振蕩混勻，孵育15min；（2）加入2m l氯化銨裂解液的工作液，振蕩均勻，作用 10min，1500 r/min 離心 5min，去上清；（3）加入100l磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸后上機檢測。

1.4統計方法 采用SPSS17.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，兩組比較采用 檢驗，＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1CD19+CD24highCD27+表型細胞及CD24highCD27+CD38high表型Breg細胞的測定 首先通過前向角散射（FSC）及側向角散射（SSC）兩個參數圈門標記出淋巴細胞群，應用 FSC參數和 CD19單抗標記出CD19+B淋巴細胞，通過CD24單抗及CD27單抗從CD19+B淋巴細胞標記出CD24highCD27+細胞，最后通過 CD38單抗從 CD24highCD27+淋巴細胞標記出CD24highCD27+CD38high細胞（封二彩圖 1）。

2.2CD19+CD24highCD27+Breg細胞在ITP患者的表達 ITP患者的CD19+CD24highCD27+細胞占CD19+淋巴細胞百分數為（14.167 4±12.1）%，對照組為（33.053 8±10.3）%，ITP患者組低于正常對照組（=6.487=0.000）。見封二彩圖2。

2.3CD24highCD27+CD38highBreg細胞在ITP患者中的表達 ITP患者的 CD24highCD27+CD38highBreg細胞占 CD19+細胞的中位數為 0.63%，均值為（1.28±1.56）%，而占CD19+CD24highCD27+細胞中位數6.725%，均數為（8.3775±8.02）%。

3　討論

Breg細胞又被稱為B10細胞，通過分泌白細胞介素10（IL-10）和腫瘤生長因子-（TGF-）等細胞因子，抑制Th1、CD8+細胞毒T細胞、DC細胞、單核細胞及Th17等細胞或刺激Tr1、Foxp3+Treg細胞（抑制性T細胞）發揮免疫調節功能。大多數B10細胞同時表達CD24和CD27，新鮮外周血中IL-10+B10細胞主要存在于 CD24high或 CD27+B細胞亞群中，CD24highCD27+B細胞占外周血 B淋巴細胞25%左右。LPS+PIB刺激5h，CD24highCD27+亞群產生IL-10的能力是 CD24lowCD27－B細胞的10倍以上；而CD40L、LPS、LPS+CD40L、CpG 或 CpG+CD40L 刺激72h，CD24highCD27+B細胞分泌IL-10的能力亦顯著優于CD24lowCD27－B細胞，說明B10細胞及其前體細胞均存在于CD24highCD27+亞群中，屬于CD24highCD27+B細胞的一個亞群[7]，CD24highCD27+B細胞轉化為CD24highCD27+CD38highBreg細胞需要細胞因子的刺激。本研究顯示，健康對照CD24highCD27+細胞占外周血CD19+B淋巴細胞的33%，CD24highCD27+CD38highBreg細胞僅占CD19+B淋巴細胞的1%左右，可能與檢測前未予CD40L、LPS或CpG等刺激有關。

Breg細胞功能缺陷或數量異常在自身免疫性疾病發生中具有重要作用。Blair等[1]研究證明，系統性紅斑狼瘡（SLE）患者的CD19+CD24highCD38high細胞與健康人相比，其產生IL-10的能力及抑制T細胞因子產生的能力均受到損害，表明SLE患者Breg的功能有缺陷。Flores-Borja等[3]發現，在類風濕關節炎（RA）患者CD19+CD24highCD38highB細胞不能將CD4+CD25－T細胞轉化為Treg細胞或抑制T(H)17的發展，但卻保持了抑制T(H)1細胞分化的能力，活動性RA患者外周血CD19+CD24highCD38highB細胞數量減少，是引起RA的重要原因。本研究發現ITP患者外周血CD19+CD24highCD27+細胞數顯著低于健康對照組，提示ITP患者可能存在Breg細胞數量異常。Li等[8]發現慢性ITP患者CD19+CD24highCD38highBreg細胞數量減少及其功能的下降，IL-10的表達及TNF-的抑制作用減弱。徐偉來等[9]發現新診斷ITP患者、持續或慢性ITP患者的CDl9+CD24highCD27+細胞均低于健康對照組，說明Breg細胞異常是ITP發生的重要機制之一。

綜上所述，CD19+CD24highCD27+細胞與CD24highCD27+CD38high細胞是人外周血中重要的Breg細胞，ITP患者存在CD19+CD24highCD27+細胞數量減少與功能缺陷，與ITP的發生可能有關。

參考文獻：