武權生教授周期療法對乳腺增生病模型大鼠ER、PR、ERK的影響*

張小花 ，申 劍，武權生△，蘇珊珊

1甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000;2桓臺縣中醫院

武權生教授是甘肅省名中醫，在長期醫療實踐中積累了豐富的治療乳腺增生病(hyperplasia of mammary gland，HMG)的經驗，在臨床上尤其擅長用疏肝散結、補腎柔肝周期療法治療HMG［1］。本研究旨在探討武權生教授周期療法治療HMG的作用機制，現將結果報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取SPF級3～4月齡、健康雌性SD大鼠90只，體質量(200±20)g，由甘肅中醫藥大學動物實驗中心SPF級實驗室提供，實驗動物合格證號：SYXK(甘)2011-0001-62001000000069。

1.2 主要試劑、藥品 苯甲酸雌二醇注射液(杭州動物藥品廠，批號：140429)；生理鹽水(辰欣藥業股份有限公司，批號：1206191101)；黃體酮注射液(浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：130702)；三苯氧胺(揚子江藥業集團有限公司，批號：14042911)；逍遙丸(蘭州佛慈制藥股份有限公司，批號：14A28)；中藥(Ⅰ號方藥物組成：柴胡、赤芍、枳實、川楝子、夏枯草、白蒺藜、全瓜蔞、鱉甲、王不留行、當歸、生地黃、海藻、昆布；Ⅱ號方藥物組成：柴胡、醋香附、延胡索、王不留行、川楝子、夏枯草、當歸、杭白芍、海藻、昆布、何首烏、菟絲子、肉蓯蓉、巴戟天、知母、黃柏)。以上藥物均購自甘肅中醫藥大學附屬醫院藥劑科；兔抗鼠細胞外調節蛋白激酶(ERK)抗體(編號：ZS-940，批號：G0110)，兔抗鼠雌激素受體(ER)抗體(編號：ZS-5420，批號：23546)，兔抗鼠孕激素受體(PR)抗體(編號：ZS-5380，批號：23546)均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法 從90只大鼠中隨機抽取20只，為空白組，右下肢肌肉注射生理鹽水注射液0.2 mL/(kg·d)，共30天。其余70只大鼠進行造模［2］：大鼠右下肢每日肌注苯甲酸雌二醇注射液0.5 mg/(kg·d)，25天后，改為肌肉注射黃體酮注射液4.5 mg/(kg·d)，共5天。實驗第31天隨機從造模組和空白組中分別抽取10只大鼠，脫臼處死，楔形取下第3對左側乳房，置于10%的甲醛溶液中固定，包埋切片，HE染色后在光鏡下觀察組織形態學變化，觀測造模是否成功。造模成功后將60只大鼠按灌服藥物不同隨機分為6組，每組10只，分別為模型組、逍遙丸組、三苯氧胺組及中藥低、中、高劑量組。空白組和模型組給予生理鹽水0.2 mL/(kg·d)灌胃，其余5組灌胃藥物劑量根據人與動物每公斤體質量劑量換算系數表換算。其中逍遙丸組灌服逍遙丸混懸液0.8 g/(kg·d)；三苯氧胺組灌服三苯氧胺水溶劑3.6 mg/(kg·d)；中藥組先灌服Ⅰ號方10天，低、中、高劑量組分別為11.1、22.2、44.4 g/(kg·d)，后灌服Ⅱ號方 20 天，低、中、高劑量組分別為9.6、19.2、38.4 g/(kg·d)。

1.4 觀察指標 分別于造模后、灌服Ⅰ號方10天后、灌服Ⅱ號方20天后測量大鼠第3對乳房左側乳頭的直徑。末次灌胃24小時后脫臼處死大鼠，無菌操作楔形取下大鼠第3對左側乳房，用10%中性甲醛溶液固定后分別進行病理切片，免疫組化法檢測ER、PR、ERK陽性表達。免疫組化法檢測 ER、PR、ERK 陽性表達的判斷標準［3］：乳腺的導管及小葉上皮細胞的核和/或胞漿呈現棕黃色著色時判為陽性。未見陽性細胞表達計為(-)；陽性細胞數小于總數的20%，而局部見少量較強著色的陽性細胞計為(±)；若陽性細胞率大于20%，依據陽性細胞的數目由少到多、著色由淺到深依次計為(+)(++)(+++)(++++)。計算陽性率時將(±)計入陽性范圍；(-)(±)(+)(++)(+++)(++++)，分別計為0、1、2、3、4、5 分，其積分值越高，則 ER、PR、ERK 含量越高。試驗期間所有實驗動物分籠飼養，室溫24～27℃，相對濕度為 49%～61%，通風良好，標準飼料，自由進食飲水。

1.5 統計學方法 數據采用SPSS 17.0統計軟件處理，計量資料以(±s)表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 一般情況 與空白組大鼠相比，造模第12天起其余各組大鼠開始出現喜聚集、毛發粗糙、具有攻擊性、乳房色紅，造模結束后出現精神不振、爪涼、易激惹、乳房色紅、透毛可見；用藥后上述表現不同程度好轉，活動增加，易激惹、乳房紅腫現象基本消失。造模后，各造模組大鼠的乳頭直徑與空白組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，各造模組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)；灌服Ⅰ號方10天后各用藥組大鼠乳頭直徑縮小，與空白組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，各造模組間比較無明顯差異(P＞0.05)；灌服Ⅱ號方20天后大鼠乳頭直徑進一步縮小，除中藥高劑量組外，其余各組與空白組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，各用藥組與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠乳頭直徑變化情況(±s) m m

表1 各組大鼠乳頭直徑變化情況(±s) m m

注：#表示與空白組比較，P＜0.05；*表示與模型組比較，P＜0.05

組別 只數 造模后乳頭直徑 灌服Ⅰ方后乳頭直徑 灌服Ⅱ方后乳頭直徑空白組 10 0.83±0.13* 0.98±0.14* 0.92±0.09*模型組 10 1.67±0.15# 1.32±0.13# 1.33±0.13#三苯氧胺組 10 1.65±0.18# 1.28±0.09# 1.10±0.08#*逍遙丸組 10 1.67±0.13# 1.36±0.20# 1.14±0.15#*中藥低劑量組 10 1.59±0.12# 1.20±0.16# 1.09±0.11#*中藥中劑量組 10 1.65±0.22# 1.22±0.16# 1.04±0.08#*中藥高劑量組 10 1.58±0.17# 1.26±0.20# 0.90±0.09*

2.2 乳腺組織ER、PR、ERK表達強度 各組大鼠乳腺ER表達積分與模型組比較均較低，其中以空白組、中藥中劑量組最為明顯，差異有統計學意義(P＜0.05)；除空白組、中藥中劑量組外，其余各組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。各組大鼠乳腺PR表達積分與模型組比較降低，差異有統計學意義(P＜0.05)；除模型組外其余各組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 各組大鼠乳腺組織ER、PR表達積分情況(±s)分

表2 各組大鼠乳腺組織ER、PR表達積分情況(±s)分

注：*表示與模型組比較，P＜0.05

組別 只數 ER PR空白組 10 1.20±0.83* 1.80±0.84*模型組 10 4.00±1.00 4.00±1.00三苯氧胺組 10 2.00±1.22 2.20±1.30*逍遙丸組 10 2.40±0.55 2.40±0.55*中藥低劑量組 10 1.80±1.64 1.60±1.34*中藥中劑量組 10 1.20±0.45* 1.80±0.84*中藥高劑量組 10 2.60±1.81 1.60±0.55*

2.3 乳腺組織ERK表達強度 與模型組比較，各組大鼠乳腺ERK表達積分均降低，其中以空白組、中藥高劑量組最明顯，差異有統計學意義(P＜0.05)。與三苯氧胺組比較，中藥高劑量組ERK表達積分較低，差異有統計學意義(P＜0.05)。其余各組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見表3。

表3 各組大鼠乳腺組織ERK積分值(±s) 分

表3 各組大鼠乳腺組織ERK積分值(±s) 分

注：*表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與三苯氧胺組比較，P＜0.05

組別 只數 ERK空白組 10 1.90±0.74*模型組 10 3.60±1.17三苯氧胺組 10 2.80±0.79逍遙丸組 10 2.60±0.84中藥低劑量組 10 2.10±0.99中藥中劑量組 10 2.30±0.48中藥高劑量組 10 1.90±0.99*△

3 討論

HMG是一種非炎非瘤的增生性病變，與內分泌紊亂關系密切，其基本病理變化是乳腺的腺泡、導管及纖維結締組織的增生［4］。HMG的發病可以從青春期至絕經期的任一年齡，其中以25～45歲多見，35～45歲為高峰年齡，約占全部乳腺疾病的70%以上。中醫稱其為“乳癖”，沖任失調，肝郁腎虛為發病之本，血瘀氣滯痰凝為發病之標，屬本虛標實，與肝、脾、腎 3臟［5］密切相關，其癥狀常在月經前明顯加重。

在臨床診療中，武權生教授依據月經節律沖任、胞宮氣血由滿盈、溢瀉至空虛的變化和本病隨月經周期發作的特點而分段周期論治。強調“經前勿補，經后勿瀉”的原則，認為經前血海充盈，宜疏導；經后血海空虛，宜調補。因此，針對乳腺增生病在月經的不同時期制定了不同的中藥處方：Ⅰ號方重用柴胡疏肝解郁，枳實理氣解郁，泄熱破結，二者共為君藥，疏肝散結為主，一升一降，加強舒暢肝氣之功，肝氣舒，結塊散，乳痛消；川楝子理氣止痛，白蒺藜疏肝解郁，二藥相伍，疏肝解郁和胃；鱉甲、昆布、海藻軟堅散結共為臣藥，疏肝解郁，軟堅散結；當歸、王不留行活血消腫；夏枯草、全瓜蔞散結消腫清熱，共為佐使，諸藥合用，共奏疏肝清熱、軟堅散結之效。Ⅱ號方中菟絲子、巴戟天、肉蓯蓉補腎陽亦能調補沖任，三者共為君藥，腎氣健，肝氣平，則沖任調；白芍調沖任；當歸甘溫而潤，養血活血，白芍配當歸活血調經，養陰柔肝；柴胡、醋香附、川楝子疏肝解郁；知母、黃柏滋腎陰，共為臣藥，補腎柔肝，又肝腎同源，腎氣腎精充足則肝主疏泄的功能得以更好發揮；海藻、昆布、夏枯草散結消腫；何首烏補益精血，配夏枯草散結消腫；元胡活血化瘀、理氣止痛；王不留行活血通經，行血脈，共為佐使，散結消腫，活血止痛；全方共奏疏肝、補腎柔肝、調補沖任之效。兩方抓住HMG肝氣郁結，痰凝血瘀，沖任失調的病機，配伍精當，根據HMG的病理特點，攻補兼施，標本兼治而不失側重。

婦女正常乳腺中的雌、孕激素受體高表達與乳腺癌的發病率升高有關［6］，更有學者通過實驗發現乳腺組織從正常到增生終至癌變的過程中，ER的陽性表達量呈漸進性［7］。ERK2mRNA在乳腺病中表達由強到弱分別為乳腺癌、非典型增生、良性增生、正常乳腺，說明ERK2在乳腺癌發生的整個過程中為活化狀態，與乳腺增生的發病有關［8］。本研究表明，乳腺增生大鼠ER、PR、ERK含量明顯升高，而周期治療可抑制雌、孕激素受體的表達，減弱雌、孕激素對靶細胞的敏感性，從而達到治療乳腺增生的目的。

［1］陳多珍，武權生.武權生教授運用周期療法治療乳腺增生病經驗簡介［J］.新中醫，2011，43(9):135-136.

［2］羅倫才，季小平，黃蘭雅，等.均勻設計法用于乳腺增生動物模型復制的研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17(7):204-206.

［3］張珺.消核沖劑對乳腺增生病大鼠模型性激素受體及細胞增殖核抗原的影響［D］.合肥：安徽中醫學院，2006.

［4］張鳳仙，陳林興.中西醫結合治療乳腺增生病的研究進展［J］.云南中醫中藥雜志，2007，28(1):43-45.

［5］王非，吳開明.中醫對乳腺增生病的認識及實驗研究概況［J］.時珍國醫國藥，2008，19(3):622-623.

［6］陳怡君.乳腺增生中醫辨證與ER、PR表達的相關性［J］.現代診斷與治療，2014，25(8):1726-1728.

［7］魏曉麗，張玉，劉敏麗，等.乳腺癌組織中Survi vi n、K i 67的表達變化及意義［J］.山東醫藥，2013，53(3):12-14.

［8］范微，李曉夏.桂枝茯苓膠囊配合散結鎮痛膠囊治療乳腺增生臨床觀察［J］.中國藥物經濟學，2013，8(7):361-363.