山茱萸對老齡小鼠肝微粒體細胞色素P450部分亞型的影響*

呂 靜，曲雷鳴，龔 偉

遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110032

細胞色素P450(cytochrome P450)屬于藥物代謝的第一相酶，主要存在于肝臟微粒體中，是肝臟混合功能氧化酶系(MFO)的主要成份，在內源性和外源性化合物的生物轉化中起重要作用［1］，CYP450抑制是有害藥物間相互作用(Drug to drug Interactions，DDIs)產生的主要原因，占代償性DDIs 的 70%［2］。有研究表明［3］，隨著年齡的增長，大鼠肝微粒體細胞色素P450的含量減少。在P450s超家族中，CYP1～3是參與藥物代謝的主要家族，參與70%～80%的臨床藥物的生物轉化，藥物對其活性及表達的研究有助于了解DDIs或對藥物可能的毒性等做出預測。

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.Et Zucc.的干燥成熟果實，具有補益肝腎的作用，為抗衰老的名貴中藥，臨床上山茱萸常與其他藥物配伍使用，本研究以山茱萸為研究對象，考察其對小鼠肝微粒體細胞色素P450部分亞型 CYP1A1、CYP2A4、CYP2A5、CYP3A41 mRNA 表達的影響，有助于預測山茱萸與臨床其他藥物之間可能存在的 DDIs，從而指導老年患者臨床合理用藥，避免產生不良反應，降低潛在風險。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 昆明種青年小鼠10只，3～4月齡，體質量30～35 g，雌雄各半；昆明種老年小鼠30只，大于12月齡，體質量大于50 g，雌雄各半，由遼寧中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗動物生產合格證號：SCXK(遼)2003-008，實驗動物使用合格證號：SYXK(遼)20090002。

1.2 儀器與試藥 PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser，SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)，ROX plustrizol，GAPDH，CYP1A1、CYP2A4、CYP2A5、CYP3A41等均購于大連寶生物工程有限公司；山茱萸藥材由遼寧中醫藥大學附屬醫院藥劑科提供；山茱萸含藥鼠糧由遼寧長生生物科技有限公司提供，低、高劑量組含藥鼠糧含山茱萸濃度分別為0.04、0.36 g/g，模型組及對照組給予正常鼠糧。

1.3 方法

1.3.1 分組及給藥 將老年小鼠30只隨機分為3組，分別為老年模型組、山茱萸高劑量組、山茱萸低劑量組，以3～4月齡小鼠為成年對照組。給藥組分別給予不同濃度的含藥鼠糧，老年模型組、成年對照組給予正常鼠糧。

1.3.2 RT-PCR檢測 連續給藥3個月后，分別用10%水合氯醛麻醉小鼠，固定，剪開腹腔，取肝臟于Trizol中勻漿，使用PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒，首先提取總RNA，逆轉錄合成第1鏈互補cDNA，通過特異性引物對小鼠肝組織中的CYP1A1、CYP2A4、CYP2A5、CYP3A41和內參基因 GAPDH進行擴增［4］，使用Stratagene Mx3000p熒光定量PCR儀進行檢測，基因引物序列見表1，溶解曲線，擴增曲線，閾值曲線見圖1—3。

表1 引物序列

1.4 統計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行數據分析，計量資料以(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

老年模型組小鼠肝微粒體細胞色素P450亞型 CYP1A1、CYP2A4、CYP2A5、CYP3A41基因相對表達量均顯著低于成年對照組大鼠的相關基因表達。給予不同劑量山茱萸含藥鼠糧后，山茱萸高、低劑量組 CYP1A1、CYP2A4、CYP2A5、CYP3A41基因相對表達量均顯著升高，且山茱萸高劑量組作用強于低劑量組，見表2。

表2 基因相對表達量

3 討論

肝藥酶主要參與藥物代謝，其相關亞型基因表達量降低，可能是導致藥物代謝緩慢，發生不良反應的主要原因。本研究結果表明，衰老小鼠肝細胞中 CYP1A1、CYP2A4、CYP2A5、CYP3A41基因的表達量顯著低于成年小鼠，給予含山茱萸的鼠糧后，肝細胞中CYP1A1、CYP2A4、CYP2A5、CYP3A41基因的表達量顯著升高，表明中藥山茱萸有誘導肝藥酶的作用，可為老年人合理用藥提供依據。

在P450s超家族中CYP1～3是參與藥物代謝的主要家族，參與70%～80%的臨床藥物的生物轉化，P450s抑制是臨床治療藥物DDIs主要的成因之一，山茱萸可對P450相關亞型CYP1A1、CYP2A4、C YP2A5、CYP3A41基因產生誘導，可使其血藥濃度降低，減少由于協同用藥產生毒性的可能。

CYP1A1參與烴類致癌物的代謝［5］，大多數化學致癌物都是CYP1A1的底物［6］。山茱萸能誘導CYP1A1 mRNA的表達，表明該藥長期服用可能導致體內致癌代謝物堆積。

小鼠肝中CYP2A5與人肝中CYP2A6有高度的同源性，且功能相似［7-8］，CYP2A6是人體內重要的藥物代謝酶，其參與環磷酰胺、丙戊酸鈉、咖啡因及尼古丁等代謝，山茱萸能誘導CYP2A5 mRNA的表達，當山茱萸與通過CYP2A5代謝的其他藥物聯合應用時需謹慎，以避免產生代謝性藥物相互作用導致的藥物不良反應。

CYP3A41與CYP2A4目前研究較少，其代謝主要與激素相關［9］，本研究結果表明，12月齡老年模型組小鼠肝細胞CYP3A41與CYP2A4 mRNA的表達顯著低于6月齡成年對照組小鼠的基因表達，與12月齡小鼠已進入老年，激素代謝水平降低相關，山茱萸能誘導CYP3A41與CYP2A4 mRNA的表達，可能與山茱萸能調節老年小鼠激素代謝相關［10］。

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