葡萄酒中氨基甲酸乙酯的變化規律及控制研究

朱亞楠，吳玉文，王煥香，商華，傅曉方，郜成軍，趙曉寧，馮振亮，鄭紫淼

（中國長城葡萄酒有限公司，河北懷來 075400）

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC）廣泛存在于煙草葉及香煙的一種天然成分，是發酵食品和酒精飲料（如葡萄酒、白酒和黃酒等）生產中所產生的一種代謝物質[1-3]。早在1943年就被證實是一種致癌物質。研究表明，EC是一種多位點致癌物，可導致嚙齒類動物肺癌、淋巴癌、肝癌和皮膚癌等疾病，并且乙醇對EC的致癌性有促進作用[4-5]。

1985年，加拿大政府首次規定了不同酒精飲料中EC的最高含量[6]，美國就當地生產的食品采取自愿制定EC安全含量標準的做法，歐盟一些成員國也規定了酒精飲品中EC最高限量。在亞洲，韓國規定葡萄酒的EC最高限量30 μg/L，而中國目前還未對葡酒中的EC進行限量規定。目前，隨著食品安全趨勢發展和消費者對食品安全的關注，我國發展歷史較短的葡萄酒行業由于缺乏系統對葡萄酒EC含量等的安全性評估，其產品質量安全頻繁受到國外質疑。國內目前對EC的研究集中在萄汁中精氨酸、尿素、瓜氨酸對葡萄酒中含量的影響以及發酵溫度、釀酒酵母菌種類、酵母泥陳釀技術對含量影響[7-10]。本文分析了葡萄酒釀造工藝條件對氨基甲酸乙酯生成的影響，降低氨基甲酸乙酯生成量的釀造工藝條件，并測定了我國不同類型的干紅和干白葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量，以期為我國葡萄酒安全標準中氨基甲酸乙酯限量指標提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器及試劑

天然葡萄汁：2016年赤霞珠（Cabernet Sauvignon），10月5日采摘于長城葡萄基地，破碎除梗后添加0.04 g/L果膠酶和60 mg/L SO2。

土壤：收集于長城釀酒葡萄園5個不同地塊土壤，采收后進行密封保存，并送檢驗機構檢驗。

葡萄酒樣品：原酒產地涉及山東煙臺4個、河北沙城9個、河北昌黎7個、新疆五家渠5個等主要產區，品種主要有‘赤霞珠’‘美樂’‘西拉’‘龍眼’‘霞多麗’‘雷司令’。

發酵輔料：AWRI796酵母（澳/maurivin）、CY3079酵母（法/萊蒙特）、發酵助劑 Fermaid KTM（拉弗德）。

設備：90 t發酵罐、葡萄酒瓶、5 L廣口瓶、打塞器、FOSS葡萄酒分析儀。

1.2 土壤和原料檢測方法

在葡萄生長季節以及采收期選取沙城產區5塊不同的釀酒葡萄園，每塊葡萄園采用“S”形取樣法或者五點交叉取樣法取樣，取樣深度為30 cm，各個取樣點土層深度、取土厚度和寬窄一致；裝入干凈的塑料袋中即可。土壤樣品中的水解性氮含量按照LY/T 1228—2015中的容量法進行檢測。

2016年10月原料成熟后采摘上述5塊葡萄園中的赤霞珠葡萄，通過FOSS葡萄酒分析儀進行可吸收氮含量的檢測，然后將5個地塊的葡萄按照同一發酵工藝進行發酵，所發酵的原酒采用固相萃取（SPE）結合GC-MS法測定原酒中EC的含量[11-12]。

1.3 發酵過程中輔料添加方法

選取上述基地中可吸收氮含量不同的4份原料，每份原料平均分為2組，將發酵助劑設置為單因素變量，一組在發酵過程中添加助劑，一組不加，發酵結束后采用SPE結合GC-MS法測定原酒中EC的含量。

1.4 葡萄酒儲存時間與存儲溫度分析方法

從公司產品留樣室中選取2007—2013年赤霞珠干紅葡萄酒和2006—2011年龍眼干白葡萄酒，采用SPE結合GC-MS法測定EC含量。選取2004—2005和2007—2009年的赤霞珠干紅葡萄酒在10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃儲存條件下的產品，每半年對葡萄酒中的EC含量進行測定分析[13]。

表1 不同土壤和葡萄氮含量與原酒中EC含量Table 1 Grape nitrogen content and the raw wine EC content in different soil

2 結果與分析

2.1 土壤和原料的含氮量與葡萄酒中EC含量的關系

由表1可以看出，土壤中的水解性氮含量與原料中的可吸收氮含量以及原酒中的EC含量有密切的關系，土壤中的氮元素含量越高，原料中的可吸收氮含量也越高，最終使得原酒中EC的含量也越高。因此，種植過程中要盡量控制氮肥的使用，使原料可吸收氮含量控制在160～180 mg/L。

2.2 發酵過程中的發酵助劑的添加對原酒中EC含量的影響

由表2可以看出，原酒中的EC含量和原料中的可吸收氮含量呈正相關；相同可吸收氮含量的原料，在發酵過程中使用發酵助劑的原酒比未使用發酵助劑的原酒EC含量高，其中可吸收氮小于190 mg/L的原料添加助劑和未添加助劑的原酒EC含量差別較小，而高于190 mg/L的原料在發酵過程中添加助劑與未添加助劑則差別較大，由此可以得出，對于原料可吸收氮高于190 mg/L時，在發酵過程中盡量控制發酵助劑的使用。

表2 發酵助劑的添加對赤霞珠原酒EC含量的影響Table 2 Effects of fermentation auxiliaries on the EC content of Cabernet Sauvignon raw wine

2.3 國內各個產區葡萄酒EC含量分析以及貯存過程葡萄酒EC含量的影響因素

通過表3數據可以看出，新發酵原酒EC含量較低，基本集中在10 μg/L以下，有個別原酒數值高于10 μg/L，可以說明新疆發酵原酒EC含量均保持在較低的范圍內。

從樣品留樣室中選取龍眼干白不同年份的留存樣品，進行檢測對比，分析儲存時間對產品中EC含量的影響。

由圖1可以看出干紅、干白原酒在儲存過程中，隨著儲存時間的增長，原酒中EC含量呈增加的趨勢。

表3 不同產區、品種原酒中的EC含量Table 3 EC content of raw wine in different producing regions and varieties

圖1 沙城產區不同儲存時間的葡萄酒產品EC含量的變化Figure 1 Changes in EC content of wine products in different storage time in Shacheng

為發現原酒中EC含量是否與貯存溫度有關系，我們儲存溫度為10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃的庫房取相同年份的成品酒，進行EC含量的對比，

由圖2可以清楚的發現，葡萄酒中的EC含量與儲存時間和儲存溫度有明顯的相關性，隨著儲存溫度升高、儲存時間的增長葡萄酒中EC含量也在升高。有研究表明，溫度是促進酒中EC產生速率的重要因素[14]。

圖2 沙城產區成品酒在不同儲存溫度條件下EC含量的變化Figure 2 Changes of EC content in different storage temperature of wine in Shacheng

3 討論與結論

EC是一種主要產生于發酵食品和飲料中的致癌物質。哪種物質是影響氨基甲酸乙酯含量的主要前體物質，哪些途徑是葡萄酒中氨基甲酸乙酯合成的主要路徑，目前沒有相關的研究報道。因此，某種意義上說，葡萄酒及其前體物質代謝生成機制及控制技術的研究仍有待于探討與研究[15]。近年來，各國食品安全部門有關EC的報道不斷出現，并紛紛出臺相關限量標準。目前，我國還沒有對包括葡萄酒在內的發酵飲料和食品中EC含量進行限定的標準和法規[16]。

通過對我國主要產區葡萄酒樣品EC含量的分析發現，新釀葡萄酒中EC含量在2.17～13.05 μg/L，樣品間差異較大。紅葡萄酒中EC含量高于白葡萄酒。我國葡萄酒中EC含量的標準建議新釀原酒的EC含量低于30 μg/L。在EC含量控制方面應該關注葡萄栽培中氮肥的大量使用，以免葡萄的可吸收氮含量過高；發酵過程中助劑的添加，如果原料可吸收氮含量高于190 mg/L時將控制發酵助劑的使用，在發酵過程中控制發酵溫度低于35 ℃；儲存溫度和時間，葡萄酒產品EC含量隨著儲存溫度的升高、儲存時間的延長而升高，應在低于40 ℃環境中儲存，并且盡快飲用。

[1]HASNIP S, CREWS C, POTTER N, et al. Survey of ethyl carbamate in fermentated foods sold in the United Kingdom in 2004[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007,55(7): 2755-2759.

[2]KIM Y K, KOH E, CHUNG H J, et al. Determination of ethyl carbamate in some fermented Korean foods and beverages[J].Food Additives and Contaminants, 2000, 17(6): 469-475.

[3]DE MELO ABREU S, ALVES A, OLIVEIRA B, et al.Determination of ethyl carbamate in alcoholic beverages: an interlaboratory study to compare HPLC-FLD with GC-MS methods[J]. Analytical and bioanalytical chemistry, 2005, 382(2):498-503.

[4]DE STEFANI E, BOFFETTA P, DENEO-PELLEGRINI H, et al. The effect of smoking and drinking in oral and pharyngeal cancers: a casecontrol study in Uruguay[J]. Cancer Letter, 2007,246(1/2): 282-289.

[5]梁新紅, 孫俊良, 曾潔, 等. 葡萄酒中氨基甲酸乙酯形成及質量控[J]. 釀酒科技, 2009(10): 32-36.

[6]吳帥, 馬佩選, 張燕, 等. 葡萄酒中氨基甲酸乙酯的形成機理及檢測方法[J]. 中外葡萄與葡萄酒, 2010(3): 66-69.

[7]陸健, 曹鈺. 葡萄酒中氨基甲酸乙酯的研究[J]. 食品與發酵工業, 1996, 22(3): 79-82.

[8]張穎, 劉國新, 朱柳楊, 等.氨基酸與葡萄酒中氨基甲酸乙酯的關系研究[J]. 現代食品科技, 2015, 31(9): 296-300, 313.

[9]吳世嘉, 王洪新. 發酵食品中氨基甲酸乙酯的研究進展[J]. 化學與生物工程, 2009, 26(9): 15-19.

[10]夏文娟, 段輝, 李皓.水果白蘭地釀造過程中氨基甲酸乙酯形成機理的研究進展[J].中外葡萄與葡萄酒, 2013(3): 43-45.

[11]李鳳華, 曹艷平, 王錫寧. GC-MS法測定酒中的氨基甲酸乙酯[J]. 中國衛生檢驗雜志, 2009, 19(6): 1240-1241, 1286.

[12]王健, 艾濤波, 岳清洪. 固相萃取和同位素內標法檢測白酒中氨基甲酸乙酯[J]. 中國釀造, 2015, 34(1): 115-117.

[13]吳帥, 馬佩選, 張燕, 等. 葡萄酒中氨基甲酸乙酯的形成機理及檢測方法[J]. 中外葡萄與葡萄酒, 2010(3): 66-69.

[14]梁萌萌. 葡萄酒中氨基甲酸乙酯控制技術的研究[D]. 新疆農業大學, 2014: 1-50.

[15]高年發, 寶菊花. 氨基甲酸乙酯的研究進展[J]. 中國釀造,2006, 162(9): 1-4.

[16]于英, 李記明, 沈志毅, 等. 葡萄酒中氨基甲酸乙酯的含量測定及釀造工藝對其含量的影響[J]. 食品與發酵工業, 2012(1):152-155.