含烏司他丁自體冷血心臟停搏液對保護(hù)心肌細(xì)胞的分析

陳 偉，李小波，梁英平

(1.陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院，陜西 咸陽 712000；2.上海遠(yuǎn)大心胸醫(yī)院，上海 200235)

室間隔缺損(ventricular septal defect，VSD)是心室間隔各部分發(fā)育不全或相互融合不良而引起的心室間血流交通異常，為兒童最常見的先天性心臟病之一，約占我國小兒先天性心臟病的一半[1]。目前，VSD主要通過體外循環(huán)VSD修補(bǔ)術(shù)進(jìn)行治療，而VSD修補(bǔ)術(shù)中減輕再灌注損傷保護(hù)心肌細(xì)胞是恢復(fù)心功能的關(guān)鍵，但目前使用的心臟停搏液臨床療效不太理想。相關(guān)研究表明，烏司他丁(Ulinastatin，UST)能抑制心肌抑制因子產(chǎn)生，防止手術(shù)刺激引起對內(nèi)臟器官與細(xì)胞的損傷[2-3]。本文主要探討含烏司他丁自體冷血心臟停搏液對行體外循環(huán)VSD修補(bǔ)術(shù)患兒缺血再灌注損傷心肌的保護(hù)作用，結(jié)果如下。

1對象與方法

1.1研究對象

選取2013年1月至2016年3月在上海遠(yuǎn)大心胸醫(yī)院行體外循環(huán)VSD修補(bǔ)術(shù)的96例患兒，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組48例患兒，男性25例，女性23例，平均年齡(3.7±0.5)個(gè)月，平均體重(5.1±0.6)kg；對照組48例患兒，男性24例，女性24例，平均年齡(3.4±0.6)個(gè)月，平均體重(4.9±0.8)kg。納入標(biāo)準(zhǔn)[4-5]：①經(jīng)彩色多普勒超聲心電圖確診；②心功能Ⅱ～Ⅲ級；③術(shù)前肝腎功能正常者。排除標(biāo)準(zhǔn)[6]：①合并嚴(yán)重原發(fā)性疾??；②末梢血象異常；③肺動脈壓/主動脈壓>0.9者。兩組患兒性別、年齡、體重、心功能分級差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。本研究均獲得受試者及其監(jiān)護(hù)人知情同意，已獲醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1心臟停搏液的配制

對照組：在體外循環(huán)前，從主動脈根部快速抽取血液，20～40s，血液與晶體比例為4∶1，抽取過程中維持主動脈收縮壓≥40mmHg，K+濃度約為20mmol/L，抽取結(jié)束后，補(bǔ)充血容量維持循環(huán)穩(wěn)定，將心臟停搏液冷凍制成自體冷血心臟停搏液。實(shí)驗(yàn)組：將純度為5 000IU/kg的UST(國藥準(zhǔn)字H19990133)加入抽取制備的心臟停搏液中，心臟停搏液的抽取和制備均與對照組相同。

1.2.2心臟停搏液灌注的方法

實(shí)驗(yàn)組和對照組的患兒均進(jìn)行全身麻醉和氣管插管，采用索林S5人工心肺機(jī)，行體外循環(huán)降溫后阻斷主動脈的時(shí)候，實(shí)驗(yàn)組使用上述方法配置好的含UST自體冷血心臟停搏液在主動脈根部進(jìn)行灌注，而對照組則使用自體冷血心臟停搏液，灌注劑量均為35mL/kg，灌注壓力為40mmHg，間隔時(shí)間為35min，灌注結(jié)束后進(jìn)行改良超濾，降低體內(nèi)水分、改變血液稀釋狀態(tài)并減少輸血。兩組患兒的手術(shù)均由同一組醫(yī)生、麻醉師、體外循環(huán)師完成。

1.3觀察指標(biāo)

記錄兩組患兒行體外循環(huán)室間隔缺損修補(bǔ)術(shù)過程中的主動脈阻斷時(shí)間、體外循環(huán)時(shí)間、自動復(fù)跳率及心室顫動發(fā)生率；采用TUNEL法(TdT-mediated dUTP nick-end labeling)檢測觀察兩組患兒行體外循環(huán)室間隔缺損修補(bǔ)術(shù)中心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量，計(jì)算體外循環(huán)前5min和主動脈開放10min時(shí)兩組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總觀察細(xì)胞數(shù)×100%)；采用免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測體外循環(huán)前5min和主動脈開放10min兩組患兒心肌Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達(dá)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±S)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<α認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組患兒室間隔缺損修補(bǔ)術(shù)情況比較

兩組患兒手術(shù)均成功，自動復(fù)跳率和心室顫動發(fā)生率均為100%、0。實(shí)驗(yàn)組和對照組患兒的主動脈阻斷時(shí)間和體外循環(huán)時(shí)間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為0.300、-0.858，均P>0.05)，見表1。

2.2兩組患兒心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

體外循環(huán)前5min，實(shí)驗(yàn)組和對照組患兒的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；主動脈開放10min時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對照組患兒的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)均高于體外循環(huán)前5min(t值分別為20.717、43.325，均P<0.05)，但實(shí)驗(yàn)組患兒的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)低于對照組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表2。

表1兩組患兒VSD修補(bǔ)術(shù)情況比較(χ±S)

Table 1 Comparison of VSD repair between two groups(χ±S)

組別例數(shù)(n)主動脈阻斷時(shí)間(min)體外循環(huán)時(shí)間(min)實(shí)驗(yàn)組4834．83±4．1454．28±4．38對照組4834．56±4．6555．12±5．18t0．300-0．858P0．764 0．393

表2兩組患兒心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較(χ±S)

Table 2 Comparison of myocardial apoptosis index between two groups(χ±S)

組別例數(shù)(n)體外循環(huán)前5min主動脈開放10min實(shí)驗(yàn)組486．98±0．5314．27±2．38對照組487．15±0．4825．84±2．95t-1．647-21．148P 0．103<0．05

2.3兩組患兒體外循環(huán)前5min和主動脈開放10min時(shí)心肌Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達(dá)比較

體外循環(huán)前5min，實(shí)驗(yàn)組和對照組患兒心肌Bcl-2蛋白、Bax蛋白表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；主動脈開放10min時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對照組患兒心肌Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達(dá)均顯著高于體外循環(huán)前5min(t值分別為83.360、50.796、29.433、49.332，均P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組心肌Bcl-2蛋白優(yōu)于對照組，心肌Bax 蛋白則低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表3。

表3兩組患兒心肌Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達(dá)比較(χ±S)

Table 3 Comparison of myocardial Bcl-2 protein and Bax protein expression between two groups (χ±S)

組別 例數(shù)(n) 體外循環(huán)前5min 主動脈開放10min Bcl?2蛋白Bax蛋白Bcl?2蛋白Bax蛋白實(shí)驗(yàn)組4813．58±0．948．58±0．8467．48±4．3823．83±3．49對照組4813．75±0．848．33±0．9339．57±3．4248．54±5．57t-0．9341．38234．797-26．045P 0．3530．170<0．05<0．05

3討論

3.1室間隔缺損修補(bǔ)術(shù)的不良影響

隨著心臟手術(shù)的技術(shù)和設(shè)備、體外循環(huán)技術(shù)、麻醉技術(shù)及手術(shù)后監(jiān)護(hù)水平的不斷提高，VSD修補(bǔ)術(shù)的成功率也大大提高。但由于嬰幼兒心肌細(xì)胞尚未發(fā)育成熟，與成熟心肌在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能及代謝特點(diǎn)上有顯著差異，且VSD患兒的心功能較正常兒童有不同程度的降低，VSD修補(bǔ)術(shù)中保護(hù)心肌細(xì)胞的方法不夠完善，體外循環(huán)和全身麻醉過程也會對患兒心功能產(chǎn)生一定的影響，造成患兒心肌細(xì)胞損傷，是導(dǎo)致術(shù)后心功能不全的重要原因[7]。因此，減輕患兒心肌細(xì)胞的損傷程度是VSD修補(bǔ)術(shù)后心臟功能能否恢復(fù)的關(guān)鍵問題。

在VSD修補(bǔ)術(shù)中，由于體外循環(huán)的介入而導(dǎo)致血液與異物表面直接接觸而引發(fā)機(jī)體的一系列炎癥反應(yīng)，造成各種蛋白酶和炎性介質(zhì)的過度釋放，而這些介質(zhì)對缺血再灌注損傷起著非常重要的作用[8]。大量研究顯示，UST是一種內(nèi)源性蛋白酶抑制劑，是直接參與保護(hù)機(jī)體免受炎性損害的重要物質(zhì)，能抑制多種水解蛋白酶、糖、脂類水解酶和炎癥介質(zhì)的過度釋放，從而改善微循環(huán)和減輕心肌缺血再灌注損傷[9]。

3.2心臟停搏液對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

VSD修補(bǔ)術(shù)中常用心臟停搏液保護(hù)心肌細(xì)胞，但不同心臟停搏液的保護(hù)作用有顯著差異。有研究表明，自體冷血心臟停搏液能消除氧自由基等有害物質(zhì)，保護(hù)心肌細(xì)胞的作用優(yōu)于晶體心臟停搏液及冷血心臟停搏液，但臨床療效不太理想，患兒術(shù)后仍有不同程度的心肌細(xì)胞損傷[10]。因此，本研究使用UST配制自體冷血心臟停搏液，觀察對行體外循環(huán)VSD修補(bǔ)術(shù)患兒缺血再灌注損傷心肌是否能起到更好的保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，兩組患兒手術(shù)均成功，自動復(fù)跳率和心室顫動發(fā)生率均為100%、0。實(shí)驗(yàn)組和對照組患兒的主動脈阻斷時(shí)間和體外循環(huán)時(shí)間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩種心臟停搏液在VSD修補(bǔ)術(shù)都能起到很好的治療作用。

3.3心肌細(xì)胞凋亡的變化判斷

主動脈開放10min時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對照組患兒心肌Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達(dá)均顯著高于體外循環(huán)前5min，且實(shí)驗(yàn)組心肌Bcl-2蛋白高于對照組，而心肌Bax 蛋白則低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明實(shí)驗(yàn)組患兒的心肌損害程度低于對照組；細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡，而Bcl-2和Bax蛋白兩者是共同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中的重要途徑之一[11]，當(dāng)Bcl-2與Bax蛋白的比值減小時(shí)則細(xì)胞凋亡增加，而Bcl-2與Bax蛋白的比值增大時(shí)則阻止細(xì)胞凋亡，主動脈開放10min時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對照組的心肌Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達(dá)均顯著高于體外循環(huán)前5min，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組在主動脈開放10min后Bcl-2與Bax蛋白的比值大于對照組，說明心肌細(xì)胞的凋亡數(shù)量在減少。

綜上所述，含UST自體冷血心臟停搏液能減輕行體外循環(huán)VSD修補(bǔ)術(shù)患兒缺血再灌注時(shí)的心肌損傷，較自體冷血心臟停搏液有更好的保護(hù)心肌作用，對患兒術(shù)后心功能的恢復(fù)有更好的臨床療效。

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