活性葉酸對不良妊娠治療效果研究

梅 瑾，王 昊，盧 莎，張艷珍，陳益明，張 聞，殷一旋，毛愛芬

(杭州市婦產科醫院 杭州市婦幼保健院產前診斷/篩查中心，浙江 杭州310008)

近年的研究發現，我國的不良妊娠結局發生率較高，占妊娠總數的5%～20%[1]。不良妊娠結局包括流產、死胎、早產、胎兒畸形及先天性出生缺陷等，嚴重影響人口健康素質和社會經濟發展。葉酸是母體與胎兒間營養交換的重要物質，低血漿葉酸水平與不良妊娠結局風險增加相關[2]。亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是葉酸代謝過程中的關鍵酶，該基因多態性常導致葉酸代謝功能受損，并與胎兒先天畸形、自然流產等關系密切[3]。因此，目前的治療主要通過補充葉酸來爭取降低不良妊娠結局的發生率[4]，但對是否采用活性葉酸補充存在爭議。本課題通過探討活性葉酸與普通葉酸補充對不良妊娠結局改善的有效性，來分析葉酸補充在不良妊娠治療中的作用地位，結果報道如下。

1對象與方法

1.1研究對象

選取2014年4月至2016年4月于杭州市婦產科醫院產前診斷中心就診，曾有不良妊娠結局的育齡期婦女為研究對象，不良妊娠結局的類型包括：自然流產、胚胎停育、神經管缺陷、無腦兒、腦積水、腦癱、染色體病、先天性智力低下、先天性心臟病、唇腭裂、多發畸形等。所有研究對象經過一般問診和查體之后，均需符合以下要求：①婦科檢查、B 超檢查等已排除生殖系統解剖畸形；②無甲狀腺功能亢進/減退、糖尿病等內分泌相關疾病； ③TORCH 優生五項檢查陰性； ④生殖免疫檢測為陰性；⑤ABO及Rh血型無溶血；⑥無家族性遺傳病史；⑦無惡性腫瘤及其他全身性疾病。采用前瞻性隨機雙盲的研究方法，研究對象、發藥及隨訪的醫療人員均不知曉患者所服用葉酸的種類。將研究對象隨機分成活性葉酸組與普通葉酸組，前組每日服用活性葉酸0.8mg，后組每日服用普通葉酸0.8mg。活性葉酸組年齡(19～38)歲，平均年齡(29.57±3.63)歲，體質指數為(22.78±2.34)kg/m2；普通葉酸組年齡(21～40)歲，平均年齡(29.45±3.96)歲，體質指數為(22.59±1.92)kg/m2。兩組年齡、體質指數均無統計學差異(均P>0.05)。所有研究對象隨訪至胎兒出生。服用葉酸6個月內懷孕且為非不良妊娠結局者認為治療有效。最終完成隨訪的活性葉酸組共122例，普通葉酸組共120例。

1.2標本采集

在征得受檢者知情同意并簽字后，進行基因診斷分析。對受檢者空腹抽取外周靜脈血2mL，加入含乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetie acid，EDTA)抗凝劑的采血管內混勻。

1.3方法

采用前瞻性隨機雙盲的研究方法。活性葉酸組：給予甲基葉酸片(商品名Jarrow Formulas Methyl Folate，每片含甲基四氫葉酸葡萄糖銨鹽0.400mg)口服，每天1次，每次2片。普通葉酸組：給予復合葉酸片(Elevit Pronatal，商品名愛樂維，國藥準字號：H20140354，每片含葉酸0.800mg)口服，每天1次，每次1片。

1.3.1 DNA提取

從外周靜脈血中提取脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)所用的DNA微量樣本基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，操作步驟按照試劑盒說明書進行。同時抽取1名健康對照者外周血及1份無核酸蒸餾水為對照同時進行DNA提取操作，確保提取操作無誤。

1.3.2 熒光定量PCR檢測MTHFR基因

采用熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative polymerase chain reaction，PCR)技術來分析MTHFR基因C677T和A1298C兩個位點單核苷酸多態性的基因型。實驗反應體系中：探針工作液2μL、引物工作液1μL、5X Light Cycler master mix 4μL、分子級無菌水 10μL、DNA 3μL。qPCR擴增循環條件為：95℃，預變性10min，1個循環；95℃變性5s，57℃退火10s，72℃延伸15s，45個循環；qPCR結束后溶解曲線的條件為：95℃ 1min，45℃ 1min，45℃～68℃以0.14℃/s的升溫速率進行溶解曲線分析且在此階段采集熒光信號。反應結束后通過LightCycle480的Gene Scanning軟件(Version 1.5)對HRM曲線進行分析。每次檢測同時帶有3個標準品及2個陽性對照，以及1個陰性對照。采用雙盲對所有樣本進行分型，并從所有樣本中隨機抽提10%的樣本進行重復驗證。

1.4統計學方法

所有數據采用統計軟件SPSS 20. 0進行統計學分析。運用卡方檢驗對兩組MTHFR C677T和A1298C兩位點的基因型頻率分布、等位基因頻率分布及出生結局進行比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

活性葉酸組共有122例研究對象完成最終隨訪，普通葉酸組為120例，兩組的葉酸基因多態性分布無統計學差異(P>0. 05)。經過葉酸治療后，活性葉酸組的妊娠人數較普通葉酸組高，有統計學差異(P<0. 05)；在再次妊娠結局為不良妊娠的結果中，活性葉酸組顯著少于普通葉酸組(P<0.01)，見表1。對再次妊娠為正常妊娠的病例中進行C677T和A1298C基因多態性比較發現，C677T位點為CC野生純合型及A1298C為AA野生純合型的患者，兩組的正常妊娠率比較均無統計學差異(P>0. 05)；C677T位點的TT突變純合型、CT突變雜合型、A1298C位點的CC突變純合型的患者，活性葉酸組的妊娠率顯著高于普通葉酸組(P<0. 01)；活性葉酸組中，A1298C位點的AC雜合型的患者妊娠率也較普通葉酸組高(P<0. 05)，見表2。

表1兩組C677T和A1298C兩位點基因型頻率分布及葉酸治療后兩組妊娠及不良妊娠比較[n(%)]

Table 1 Comparison of genotype frequency distribution of C677T and A1298C locus and normal pregnancy rate/adverse pregnancy rate after treatment in two groups [n(%)]

項目活性葉酸組(n=122)普通葉酸組(n=120)χ2PC677T基因型0．0710．965CC39(31．97)40(33．33)CT51(41．80)50(41．67)TT32(26．23)30(25．00)A1298C基因型0．0510．975AA61(50．00)59(49．17)AC37(30．33)36(30．00)CC24(19．67)25(20．83)妊娠人數98(80．33)83(69．17)3．9970．046再次妊娠結局為不良妊娠5(0．51)15(18．07)7．6920．006

表2兩組C677T和A1298C基因多態性與葉酸治療后正常妊娠關系[n(%)]

Table 2 Association between normal pregnancy after treatment and C677T and A1298C gene polymorphism in two groups [n(%)]

項目活性葉酸組(n=93)普通葉酸組(n=68)χ2PC677T基因型 CC23(58．97)25(62．50)0．1030．748 CT42(82．35)29(58．00)7．1710．007 TT28(87．50)14(46．67)11．8140．000A1298C基因型 AA42(68．85)34(57．63)1．6270．202 AC30(81．08)21(58．33)4．4850．034 CC21(87．50)13(52．00)7．2650．007

3討論

3.1 5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因的多態性

人類MTHFR基因是葉酸代謝的關鍵酶，位于人類染色體1p36.3，編碼656個氨基酸，包括11個外顯子和10個內含子。MTHFR基因編碼的蛋白質轉化5，10-亞甲基四氫葉酸為5-甲基四氫葉酸，為機體的正常甲基化過程提供甲基基團。目前研究已經發現MTHFR基因有近20種基因多態性突變位點，其中最具有臨床意義的兩個突變位點是C677T和A1298C。C677T多態性突變為MTHFR基因第4外顯子的第677位核苷酸上胞嘧啶(cytosine，C)突變為胸腺嘧啶(thymine，T)，表現為3種基因型，即CC、CT和TT型。A1298C多態性突變為MTHFR基因第7外顯子上的第1298位核苷酸上腺嘌呤(adenine，A)被C替代，表現為3種基因型，AA、AC和CC型。

3.2 5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因的多態性及其與不良妊娠結局的相關性

葉酸是體內重要的甲基供體，葉酸代謝途徑的正常運轉對于維持DNA正常甲基化和DNA從頭合成以及DNA修復是至關重要的。MTHFR基因C677T基因的CT雜合型突變可使酶的活性下降35%，TT純合型突變更可使酶的活性下降70%，這一基因多態性影響葉酸的正常代謝，進而引起DNA低甲基化，干擾DNA合成和DNA損傷修復，造成DNA鏈斷裂、染色體重組改變和分離異常。孕婦對葉酸的需求量為正常人的2～3倍，一旦MTHFR基因發生風險突變而導致其對葉酸的利用能力降低，容易導致胎兒神經管畸形及唇腭裂、唐氏綜合征，以及自發性流產、胎兒宮內發育遲緩、早產及新生兒低出生體質量等葉酸代謝相關的疾病發生風險增高[5]。

3.3活性葉酸治療療效

研究表明，在健康女性中，活性葉酸的攝入與普通葉酸相比能更有效的改善葉酸的水平，并更能有效預防早孕期的神經管缺陷[6]。但在不良妊娠史患者中，活性葉酸補充與普通葉酸治療效果比較，國內尚未見報道。本研究發現，對存在不良妊娠史患者的治療中，活性葉酸的再次妊娠率較普通葉酸高，且再次妊娠的正常妊娠數顯著高于普通葉酸組(P<0.05)，說明針對此類患者，活性葉酸的療效優于普通葉酸。進一步對正常妊娠的患者進行葉酸基因多態性分析發現，對于存在C677T和A1298C位點突變的患者，活性葉酸的療效明顯，但在未存在突變的患者中，活性葉酸與普通葉酸的治療療效未見顯著性差異(P>0.05)。由此可見葉酸代謝基因C677T和A1298C位點突變可能與女性不良妊娠相關，且對于該位點突變的患者，活性葉酸治療有效。但需要指出的是，本資料未對所有的父母檢測外周血染色體，所以無法知曉父母是否為染色體異常相關患者，目前的研究也不能確定活性葉酸是否可以預防染色體病，這需要進一步的驗證。

綜上所述，葉酸代謝相關基因在不良妊娠史女性中突變率較高，此類人群應進行葉酸代謝基因多態性檢測，并根據葉酸利用能力個體化補充葉酸，以降低出生缺陷的發生。

[1]黃莉,張莉,李洪艷,等.孕產婦不良妊娠結局危險因素的巢式病例對照研究[J].中國現代醫學雜志,2015,25(9):106-109.

[2]Bergen N E,Jaddoe V W, Timmermans S,etal. Homocysteine and folate concentrations in early pregnancy and the risk of adverse pregnancy outcomes: the Generation R Study[J]. BJOG, 2012, 119(6):739-751.

[3]Shi H, Yang S, Liu Y,etal. Study on environmental causes and SNPs of MTHFR, MS and CBS genes related to congenital heart disease[J]. PLoS One, 2015, 10(6):e0128646.

[4]Kim M W,Ahn K H, Ryu K J,etal. Preventive effects of folic acid supplementation on adverse maternal and fetal outcomes[J]. PLoS One, 2014, 9(5):e97273.

[5]Nair R R, Khanna A, Singh R,etal. Association of maternal and fetal MTHFR A1298C polymorphism with the risk of pregnancy loss: a study of an Indian population and a meta-analysis[J]. Fertil Steril, 2013, 99(5):1311-1318.

[6]Obeid R, Holzgreve W, Pietrzik K. Is 5-methyltetrahydrofolate an alternative to folic acid for the prevention of neural tube defects?[J]. J Perinat Med, 2013, 41(5):469-483.