辛伐他汀在慢性阻塞性肺疾病大鼠模型中的早期干預(yù)作用

楊凱　郭璐　劉躍建

[摘要] 目的 探討早期給予辛伐他汀干預(yù)對(duì)慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠模型的影響及機(jī)制。 方法 將42只大鼠（Wistar，清潔級(jí)）隨機(jī)分為空白組、模型組和他汀組，每組14只。采用煙熏加氣道內(nèi)滴入脂多糖法復(fù)制COPD大鼠模型，他汀組在造模2周后加用辛伐他汀（5 mg/kg）灌胃治療。觀察大鼠一般表現(xiàn)；監(jiān)測(cè)體重變化；采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清及支氣管肺泡灌洗液（BALF）中白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平；血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)；免疫組織化學(xué)染色法測(cè)定肺組織中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-9）的表達(dá)；圖像分析系統(tǒng)分析各組大鼠病理改變。 結(jié)果 模型組及他汀組大鼠體重較空白組減輕（P < 0.01）。血清和BALF中IL-6、TNF-α水平，模型組及他汀組較空白組增加（P < 0.05），他汀組較模型組降低（P < 0.05）。肺組織中MMP-9表達(dá)，模型組較空白組增高（P < 0.01），他汀組較模型組降低（P < 0.05）。模型組及他汀組大鼠肺組織符合COPD病理學(xué)改變，他汀組組織損傷、重塑及炎癥浸潤(rùn)程度較模型組降低。 結(jié)論 香煙吸入聯(lián)合呼吸系統(tǒng)感染可加重肺部及全身炎性反應(yīng)程度，增加蛋白酶過度表達(dá)，參與COPD的發(fā)生發(fā)展。早期給予辛伐他汀治療，可在一定程度上減輕肺組織損傷及重塑，降低炎性反應(yīng)程度，緩解蛋白酶系統(tǒng)亢進(jìn)。

[關(guān)鍵詞] 他汀；慢性阻塞性肺疾病；大鼠；基質(zhì)金屬蛋白酶9

[中圖分類號(hào)] R563.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）12（a）-0008-05

[Abstract] Objective To explore the effects of early stage administration of Simvastatin on chronic obstructive pulmonary disease （COPD） rat model and its mechanism. Methods 42 SPF Wistar rats were randomly divided into three groups （n=14）： blank group， model group and Simvastatin group. COPD rat models were replicated with the method of inhaling cigarette smoke and intratracheal instillation of LPS. Simvastatin group rats were gave lavage treatment with Simvastatin （5 mg/kg） after 2 weeks when COPD model was established. Usual manifestations and body weights of rats from the three groups were monitored. The levels of IL-6 and TNF-α in serum and BALF were measured by double antibody sandwich enzyme-linked immuno sorbent assay （ELISA）. Leukocyte in BALF was counted by haemocytometer. The expression of MMP-9 in the lung tissues was measured by immunohistochemically. Pathological examination of lung tissues from every group was analyzed by image analysis system. Results Body weights of rats from the model group and Simvastatin group were significantly reduced compared with those of the blank group （P < 0.01）. Levels of IL-6 and TNF-α in serum and BLAF were higher in the model group and Simvastatin group than the blank group （P < 0.05）. Compared with model group， the levels in Simvastatin group were decreased （P < 0.05）. The expression of MMP-9 in lung tissues， model group was increased than the blank group （P < 0.05）， Simvastatin group was lower than the model group （P < 0.05）. The pathologic characteristics of COPD was observed in the lung tissues from Sim？鄄vastatin group and model group. Copmared with the model group， lung tissue injury， remodeling and inflammatory infiltration in Simvastation group was attenuated. Conclusion Cigarettes inhalation combined with respiratory infections can aggravate pulmonary and systemic inflammation， and up-regulate the expression of proteases， all of which are involved in the genesis and development of COPD. Simvastatin therapy as an early intervention can alleviate the lung tissue injury and remodeling to a certain degree， attenuate pulmonary and systemic inflammation and alleviate the over-activation of proteasesystem.endprint

[Key words] Statin； COPD； Rat； MMP-9

慢性阻塞性肺疾病是一種常見的以持續(xù)性呼吸道癥狀和氣流受限為特征的可以預(yù)防和治療的疾病[1]，氣流受限呈進(jìn)行性發(fā)展，與肺部對(duì)有害氣體或顆粒的異常慢性炎性反應(yīng)相關(guān)。因其發(fā)病率、致殘率和死亡率高而嚴(yán)重危害著人類的身體健康，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的醫(yī)療、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)，至2020年，COPD將位居世界死亡原因第三位、疾病經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)第五位。COPD起病隱匿，一旦出現(xiàn)臨床癥狀，往往預(yù)示著患者生活質(zhì)量、呼吸功能以及整體健康水平將逐漸進(jìn)行性下降，其急性加重更可直接導(dǎo)致患者死亡，因此在疾病早期給予積極有效的治療顯得尤為重要。但目前仍無(wú)藥物能有效改善患者病程進(jìn)展、肺功能惡化速率以及居高不下的死亡率。他汀類藥物獨(dú)立于降脂以外的多效性近年來(lái)日益獲得重視，其通過抑制膽固醇合成途徑中間產(chǎn)物（甲羥戊酸、異戊二烯、牻牛兒焦磷酸等）的生成，具有抗炎、抗蛋白酶等多重功效。多項(xiàng)研究表明，他汀類藥物能延緩COPD患者肺功能下降速度，降低急性加重頻率、住院次數(shù)及死亡率[2-3]。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠42只，180～200 g，全雄，SPF級(jí)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證：11400？鄄700052997，生產(chǎn)許可證：SCXK（京）2012-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

香煙：嬌子（時(shí)代陽(yáng)光）牌，川渝中煙工業(yè)公司，焦油10 mg，煙氣一氧化碳12 mg，煙氣煙堿量0.8 mg；脂多糖（LPS）：SIGMA公司，10 mg/支；辛伐他汀片：默沙東制藥有限公司，規(guī)格：40 mg；大鼠TNF-α酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒96T，南京建成賽浩科技有限公司；大鼠IL-6 ELISA試劑盒96T，南京建成賽浩科技有限公司；基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）抗體，兔多克隆抗體，英國(guó)Abcam公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 疾病動(dòng)物模型建立 根據(jù)計(jì)算機(jī)隨機(jī)數(shù)字表法將42只大鼠分為空白組、模型組、他汀組，每組各14只。模型組：第1、14天經(jīng)耳鏡向大鼠氣道內(nèi)滴入200 μg的LPS。余每日置于自制有機(jī)玻璃密閉熏煙箱（80 cm×60 cm×50 cm）中被動(dòng)吸煙（第2～13天、第15～60天）熏香煙2次，每次點(diǎn)燃香煙14支，持續(xù)時(shí)間1 h，間隔時(shí)間4 h，共計(jì)煙熏58 d。他汀組：在模型組基礎(chǔ)上，于第15天開始，加以辛伐他汀（5 mg/kg）灌胃，再煙熏，余操作同模型組。

1.3.2 體重檢測(cè) 每周一、四清晨空腹、造模前將大鼠置于電子天平稱上進(jìn)行體重秤量各1次，并記錄。

1.3.3 血清中IL-6、TNF-α水平測(cè)定 實(shí)驗(yàn)第60 d，稱重所有大鼠，10 mg/mL戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉后，分離腹主動(dòng)脈，抽取動(dòng)脈血5 mL，于2000 r/min離心10 min，分離血清，采用ELISA法測(cè)定血清中IL-6、TNF-α的水平，具體操作按說明書。

1.3.4 支氣管肺泡灌洗液（BALF）中IL-6、TNF-α水平測(cè)定 切開暴露胸部，結(jié)扎右主支氣管，于隆突上用套管針穿刺至左肺，以2 mL生理鹽水灌洗，緩慢回抽，每次回收約1.5 mL，反復(fù)灌洗3次，回收率要求約75%。BALF液4℃，1000 r/min離心10 min，取上清液，采用ELISA法測(cè)定BALF中IL-6、TNF-α的水平，具體操作按說明書。

1.3.5 肺組織中MMP-9的表達(dá)測(cè)定 取右肺下葉，PBS緩沖液沖洗，留取左肺門1 mm×1 cm×1 cm大小組織塊，4%多聚甲醛固定，行免疫組織化學(xué)染色，測(cè)定各組大鼠肺組織中MMP-9的表達(dá)。

1.3.6 各組大鼠肺泡計(jì)數(shù)及肺組織病理生理改變 取新鮮右肺上葉組織約1 cm×1 cm×1 cm，放入4%多聚甲醛中固定，行HE染色，光鏡下觀察各組大鼠單位面積下肺泡計(jì)數(shù)及肺組織病理生理改變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

實(shí)驗(yàn)共納入42只大鼠，每組14只。煙熏2周后，模型組及他汀組大鼠早期表現(xiàn)為煩躁、好動(dòng)、激惹，后期表現(xiàn)為精神萎靡、反應(yīng)遲緩、懶動(dòng)，進(jìn)食減少、多飲，毛發(fā)雜亂、潮濕、枯黃、無(wú)光澤。空白組反應(yīng)靈敏，精神、飲食正常，毛發(fā)色白、光滑、柔順、有光澤。

在煙熏至1個(gè)月時(shí)，模型組和他汀組各處死2只大鼠，取肺組織經(jīng)HE染色后觀察COPD模型復(fù)制效果，可見氣管支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分纖毛倒伏，但尚未見明顯肺泡腔肺泡壁破壞及肺大泡肺氣腫形成。

2.2實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組大鼠體重改變

實(shí)驗(yàn)開始前，各組大鼠間體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，模型組合和他汀組較空白組體重降低（P < 0.05），他汀組體重較模型組略有增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.3 各組大鼠BALF中IL-6、TNF-α水平差異

BALF中IL-6、TNF-α水平，模型組、他汀組較空白組表達(dá)增加（P < 0.05），他汀組較模型組降低（P < 0.05）。見表2。

2.4 各組大鼠血清中IL-6、TNF-α水平差異

血清中IL-6、TNF-α水平，模型組、他汀組較空白組水平增高（P < 0.05），他汀組較模型組減少（P < 0.05）。見表2。

2.5 各組肺組織中MMP-9的表達(dá)endprint

經(jīng)圖像分析軟件測(cè)得各組MMP-9平均分光密度，模型組較空白組表達(dá)增高（P < 0.05），他汀組較模型組表達(dá)降低（P < 0.05），他汀組與空白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），見表2。圖1中棕黃色為MMP-9蛋白的陽(yáng)性表達(dá)。

2.6 各組光鏡下單位面積下肺泡計(jì)數(shù)

光鏡下平均每個(gè)視野肺泡數(shù)量比較，模型組和他汀組較空白組減少（P < 0.05），他汀組較模型組肺泡計(jì)數(shù)有所增加（P < 0.05），見表2、圖2。

2.7 肺組織病理改變

模型組大鼠可見各級(jí)氣管、支氣管內(nèi)纖毛粘連、倒伏、脫落，杯狀細(xì)胞增生，平滑肌增生、肥厚，慢性炎癥改變伴大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；肺泡壁變薄、擴(kuò)張、破裂、融合，肺大泡及肺氣腫形成，肺泡間隔增厚；細(xì)支氣管伴行肺小動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，中膜平滑肌增生，管腔狹窄、閉塞，肺毛細(xì)血管數(shù)目減少。他汀組纖毛脫落較模型組減少，炎癥浸潤(rùn)及平滑肌增生減輕；肺泡破裂融合減少，肺泡間隔增厚略緩解；肺小動(dòng)脈炎減輕，毛細(xì)血管管腔閉塞及數(shù)目減少略緩解，見圖2。

3 討論

慢性炎性反應(yīng)是COPD的主要致病機(jī)制之一，這種炎性反應(yīng)持續(xù)存在并呈進(jìn)行性惡化[4]。IL-6、TNF-α及白細(xì)胞作為臨床常用的炎性反應(yīng)標(biāo)志物，在COPD患者體內(nèi)明顯增高，并能較好的反映患者炎性反應(yīng)程度[5-6]。

COPD大鼠體內(nèi)存在明顯的炎性反應(yīng)，多種炎癥標(biāo)志物水平較空白組中顯著升高，早期給予辛伐他汀治療后，可以改善這一炎性反應(yīng)程度，降低白細(xì)胞計(jì)數(shù)、TNF-α、IL-6等炎癥標(biāo)志物水平，具有明顯的抗炎功效。其抗炎機(jī)制可能為[7]：膽固醇合成途徑中間產(chǎn)物（甲羥戊酸、異戊二烯、牻牛兒焦磷酸等）是多種蛋白表達(dá)、酶類活化、細(xì)胞構(gòu)成的重要組成部分，對(duì)維持細(xì)胞骨架穩(wěn)定性、細(xì)胞膜流動(dòng)性及線粒體功能有著重要作用；并能調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡。辛伐他汀通過抑制膽固醇合成中間產(chǎn)物的生成，在表達(dá)、修飾和降解等多個(gè)層面降低TNF-α、IL-6和白細(xì)胞計(jì)數(shù)等炎癥標(biāo)志物水平，以此來(lái)減輕炎性反應(yīng)，調(diào)節(jié)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，使氣道、肺部的慢性炎癥得到改善[8-9]。

蛋白酶可消化彈性蛋白及肺泡壁上的多種蛋白結(jié)構(gòu)，其中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）為主要成分之一，在COPD的發(fā)生發(fā)展過程中有著重要作用。MMP-9作用底物廣泛，能降解肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞外多種基質(zhì)成分[10]；能促進(jìn)炎性反應(yīng)和組織損傷，參與了COPD患者肺組織和血管的損傷、重塑過程，是評(píng)估患者體內(nèi)蛋白酶系統(tǒng)亢進(jìn)的主要生物標(biāo)志物之一[11]。張立海等[12]研究證明辛伐他汀可以降低COPD肺大鼠MMP-9及其抑制劑的表達(dá)水平。COPD大鼠體內(nèi)蛋白酶系統(tǒng)亢進(jìn)，肺組織中MMP-9的表達(dá)明顯增高。本實(shí)驗(yàn)顯示COPD大鼠早期給予辛伐他汀治療后，也可降低肺組織中MMP-9的表達(dá)，改善蛋白酶系統(tǒng)亢進(jìn)，平衡蛋白酶-抗蛋白酶系統(tǒng)。

其抗蛋白酶機(jī)制可能與辛伐他汀阻斷甲羥戊酸、牛兒基焦磷酸的生成[13]，抑制多種信號(hào)通道（RhoA/ROCK、Ras等）的活化及異戊烯化[14]，減少M(fèi)MP-9的mRNA表達(dá)和釋放相關(guān)[15]。早期給予辛伐他汀治療，可降低COPD大鼠炎性反應(yīng)程度，改善蛋白酶系統(tǒng)亢進(jìn)，一定程度上改善肺組織損傷和重塑[16]，延緩COPD病程進(jìn)展、改善遠(yuǎn)期預(yù)后，與國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究結(jié)果一致[17-18]。

但近期國(guó)外研究結(jié)果顯示[19]，在肺功能中重度受損的患者人群中，辛伐他汀并不能降低其急性加重頻率[（1.36次/（人·年）：1.39次/（人·年），P=0.54）]、首次急性加重時(shí)間（223 d：231 d，P = 0.34）以及病死率[（30/430）：（28/447），P = 0.89]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不相符。其結(jié)果的差異原因可能為，該研究納入標(biāo)準(zhǔn)是基于COPD診斷確立，肺功能呈中重度受損后再給予辛伐他汀治療，考慮此時(shí)嚴(yán)重的病理結(jié)構(gòu)改變已近不可逆轉(zhuǎn)，同時(shí)伴有嚴(yán)重的整體健康狀態(tài)的惡化，再給予他汀類藥物治療，才導(dǎo)致其療效甚微甚至無(wú)效。

本實(shí)驗(yàn)在疾病早期（煙熏2周）即給予辛伐他汀治療，才能獲得降低炎性反應(yīng)、緩解蛋白酶系統(tǒng)亢進(jìn)、改善其肺組織損傷和重塑等功效。辛伐他汀可能在COPD早期患者人群中的獲益更為明顯，可提高其生活質(zhì)量，改善病程進(jìn)展及遠(yuǎn)期預(yù)后[20]。為COPD提供了新的治療思路，同時(shí)對(duì)COPD早期診斷有了更多的期望，再一次的闡述了早診斷、早治療的重要性。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 陳亞紅.2017年GOLD慢性阻塞性肺疾病診斷、治療及預(yù)防的全球策略解讀[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)前沿雜志，2017，9（1）：37-46.

[2] Young RP，Hopkins R，Eaton TE. Potential benefits of statins on morbidity and mortality in chronic obstructive pulmonary disease：a review of the evidence [J]. Postgrad Med J，2009，85（1006）：414-421.

[3] Dobler CC，Wong KK，Marks GB. Associations between statins and COPD：a systematic review [J]. BMC Pulm Med，2009，9：32.

[4] Agusti A，F(xiàn)aner R. Systemic inflammation and comorbidities in chronic obstructive pulmonary disease [J]. Proc Am Thorac Soc，2012，9（2）：43-46.

[5] Garcia-Rio F，Miravitlles M，Soriano JB，et al. Systemic inflammation in chronic obstructive pulmonary disease：a population-based study [J]. Respir Res，2010，11：63.endprint

[6] 潘兆寶，范玉梅，韓守華，等.血清IL-6、IL-8、纖維蛋白原水平在COPD患者中的變化及其與預(yù)后的關(guān)系[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2017，38（9）：1261-1263.

[7] Yeganeh B，Wiechec E，Ande S R，et al. Targeting the mevalonate cascade as a new therapeutic approach in heart disease，cancer and pulmonary disease [J]. Pharmacol Ther，2014，143（1）：87-110.

[8] Ghittoni R，Napolitani G，Benati D，et al. Simvastatin inhibits the MHC class Ⅱ pathway of antigen presentation by impa？鄄iring Ras superfamily GTPases [J]. Eur J Immunol，2006， 36（11）：2885-2893.

[9] 吳軼赟，廖浪霞.辛伐他汀治療慢性阻塞性肺疾病的療效及其對(duì)患者C反應(yīng)蛋白、前白蛋白和肺功能的影響[J].海南醫(yī)學(xué)，2016，27（23）：3807-3810.

[10] Pourfarzam S，Yaraee R，Hassan ZM，et al. Chemokines，MMP-9 and PMN elastase in spontaneous sputum of sulfur mustard exposed civilians：Sardasht-Iran Cohort Study [J]. Int Immunopharmacol，2013，17（3）：958-963.

[11] Simpson JL，McDonald VM，Baines KJ，et al. Influence of age，past smoking，and disease severity on TLR2，neutrophilic inflammation，and MMP-9 levels in COPD [J]. Mediators Inflamm，2013，2013：462934.

[12] 張立海，李新玲，王麗紅，等.辛伐他汀對(duì)慢阻肺大鼠MMP-9及其抑制劑表達(dá)的影響[J].臨床肺科雜志，2016， 21（6）：1018-1020.

[13] Kamio K，Liu X D，Sugiura H，et al. Statins inhibit matrix metalloproteinase release from human lung fibroblasts [J]. Eur Respir J，2010，35（3）：637-646.

[14] Kim SE，Thuy TTT，Lee JH，et al. Simvastatin inhibits induction of matrix metalloproteinase-9 in rat alveolar macrophages exposed to cigarette smoke extract [J]. Exp Mol Med，2009，41（4）：277-287.

[15] Young RP，Hopkins R，Eaton TE. Pharmacological actions of statins：potential utility in COPD [J]. Eur Respir Rev，2009，18（114）：222-232.

[16] Alexeeff SE，Litonjua AA，Sparrow D，et al. Statin use reduces decline in lung function：VA Normative Aging Study [J]. Am J Respir Crit Care Med，2007，176（8）：742-747.

[17] Kaczmarek P，Sladek K，Skucha W，et al. The influence of simvastatin on selected inflammatory markers in patients with chronic obstructive pulmonary disease [J]. Pol Arch Med Wewn，2010，120（1-2）：11-18.

[18] Horita N，Miyazawa N，Kojima R，et al. Statins reduce all-cause mortality in chronic obstructive pulmonary disease：A systematic review and meta-analysis of observational studies [J]. Respiratory Research，2014，15（1）：80.

[19] Criner GJ，Connett JE，Aaron SD，et al. Simvastatin for the prevention of exacerbations in moderate-to-severe COPD [J]. N Engl J Med，2014，370（23）：2201-2210.

[20] 董微，康萍，鐘祥柱，等.他汀類藥物在慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期患者中的作用[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2015，31（11）：1835-1837.

（收稿日期：2017-08-22 本文編輯：任 念）endprint