P16、RAR-β和APC基因甲基化聯(lián)合脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)對(duì)惡性漿膜腔積液的診斷價(jià)值*

郭建華,張吉才,李 霞,呂 軍,伍亞云,朱名安,湯顯斌,瞿華琴,楊廣全,杜 毅

(1.湖北省十堰市太和醫(yī)院/湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 442000;2.湖北醫(yī)藥學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，十堰 442000；3.湖北省竹山縣婦幼保健院檢驗(yàn)科 442200；4.湖北省十堰市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科 442000；5.湖北省十堰市太和醫(yī)院/湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院病理科 442000；6.湖北省竹溪縣中醫(yī)院檢驗(yàn)科 442300)

漿膜腔積液指在疾病情況下，胸腔、腹腔或心包腔內(nèi)積聚的過多液體。惡性漿膜腔積液是惡性腫瘤的常見并發(fā)癥之一，對(duì)其準(zhǔn)確診斷有助于判斷患者的疾病狀態(tài)。細(xì)胞病理學(xué)檢查是確定漿膜腔積液良惡性的常用方法，但其診斷的靈敏度只有40%～90%，可能造成誤診而延誤治療[1]。腫瘤標(biāo)志物及細(xì)胞因子如CA125、組織型纖溶酶原激活因子(TPA)、腫瘤壞死因子(TNF)、腫瘤特異性生長因子(TSGF)等對(duì)惡性漿膜腔積液診斷被認(rèn)為都有潛在價(jià)值，然而靈敏度和特異度低等問題使其只能作用聯(lián)合診斷的依據(jù)[2]。因此，尋找一種能夠早期及時(shí)準(zhǔn)確判斷漿膜腔積液良惡性的方法至關(guān)重要。

DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的介導(dǎo)下，將甲基選擇性添加到胞嘧啶上形成5-胞嘧啶的過程。大量研究表明，DNA異常甲基化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及細(xì)胞癌變有著密切的聯(lián)系，是除缺失和突變之外導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)失活的一個(gè)重要特征[3]。檢測(cè)SHOX2和SEPT9基因甲基化有助于對(duì)惡性漿膜腔積液的診斷[4]。

P16、視黃酸受體β(retinoic acid receptor beta，RAR-β)、結(jié)腸腺瘤性息肉病 (adenomatous polyposis coli，APC)基因都是腫瘤抑癌基因，與多種腫瘤相關(guān)，檢測(cè)P16基因在胸腔積液的甲基化有助于鑒別良惡性胸腔積液[5]。本研究擬采用甲基化特異度PCR方法聯(lián)合檢測(cè)漿膜腔積液沉淀細(xì)胞P16、RAR-β和APC基因甲基化狀態(tài)，探討其對(duì)惡性漿膜腔積液診斷價(jià)值，為臨床早期準(zhǔn)確診斷漿膜腔積液良惡性提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞來源 收集2015年1月至12月就診于湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院的患者漿膜腔積液65例，其中心包積液8例，腹腔積液9例，胸腔積液48例。患者于入院后1周內(nèi)行穿刺，抽取積液10 mL ×2管，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，1 000 r/min離心15 min，1管取沉淀細(xì)胞若干于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ａ?管取細(xì)胞沉淀物作脫落細(xì)胞學(xué)檢查。65例漿膜腔積液中，良性27例，男7例，女20例，年齡16～82歲，中位年齡65歲，均為抗感染或抗結(jié)核治療有效且確診；惡性38例，男21例，女17例，年齡42～82歲，中位年齡60歲，均經(jīng)病理及臨床檢查確診。

1.1.2試劑和儀器 使用碧云天基因組DNA小量抽提試劑盒對(duì)沉渣細(xì)胞中的基因組進(jìn)行抽提、一步法亞硫酸鹽處理試劑盒購自北京天漠，CpG甲基化酶(M.SssI)為NEB產(chǎn)品，引物由上海桑尼生物合成；PCR mix、100bp ladder、Nano Drop2000核酸蛋白檢測(cè)儀及超低溫冰箱為Thermo產(chǎn)品，凝膠成像儀為Sysgene產(chǎn)品，電泳儀為北京六一產(chǎn)品。日產(chǎn)OLYMPUS CX-31顯微鏡，蘇木精-伊紅(HE)染色液(自配)。

1.2方法

1.2.1脫落細(xì)胞學(xué)檢查 漿膜腔積液10 mL，EDTA抗凝，1 000 r/min離心15 min，取細(xì)胞沉淀物人工推片3張，自然干燥，HE染色，3張染色片均在顯微鏡下仔細(xì)查找癌細(xì)胞，并依據(jù)細(xì)胞學(xué)特征進(jìn)行分型。27例良性漿膜腔積液均未找到癌細(xì)胞；38例惡性漿膜腔積液中，腺癌14例，鱗癌11例，未分化癌3例，可疑癌細(xì)胞10例。但38例惡性漿膜腔積液患者，均經(jīng)病理或臨床確診為惡性腫瘤。

1.2.2基因組DNA的提取及亞硫酸鹽處理 參照試劑盒說明書對(duì)沉渣細(xì)胞進(jìn)行基因組DNA提取，使用Nano Drop2000檢測(cè)抽提DNA的濃度和純度，保證所提取DNA的OD260/OD280為1.6～1.8。參照說明書亞硫酸鹽處理法對(duì)DNA進(jìn)行甲基化處理。其中用CpG甲基化酶(M.SssI)處理人淋巴細(xì)胞基因組做甲基化基因的陽性對(duì)照。CpG甲基化酶(M.SssI)能識(shí)別并甲基化CpG識(shí)中所有C,使其與MSP方法所理想的DNA狀態(tài)一致，可模擬生物基因組的修飾模式，故可用來做陽性對(duì)照；以人淋巴細(xì)胞基因組為未甲基化基因的陽性對(duì)照。

1.2.3PCR擴(kuò)增 以甲基化修飾后的DNA為模板，分別用3個(gè)基因的甲基化和非甲基化特異度引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列及產(chǎn)物大小詳見表1，引物設(shè)計(jì)參見文獻(xiàn)[6]。PCR反應(yīng)體系為PCR mix 10 μL，上游引物(10 μmol/L) 0.5 μL，下游引物 (10 μmol/L)，DNA模板1 μL滅菌蒸餾水加至20 μL。PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1P16、RAR-β和APC甲基化和非甲基化基因擴(kuò)增 對(duì)27例良性漿膜腔積液和38例惡性漿膜腔積液中的基因組進(jìn)行抽提，并行亞硫酸鹽處理。甲基化特異度PCR技術(shù)對(duì)P16、RAR-β和APC基因進(jìn)行啟動(dòng)子區(qū)域甲基化檢測(cè)。PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳后，與Marker相比P16、RAR-β和APC甲基化和非甲基化基因均得到擴(kuò)增，且與預(yù)計(jì)大小相同，見圖1。

表1 引物序列及片段大小

MF:甲基化的正向引物；MR：甲基化的反向引物；UF：未甲基化的正向引物；UR：未甲基化的反向引物

2.2P16、RAR-β和APC三基因啟動(dòng)子甲基化及脫落細(xì)胞分析在兩組中頻率的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 在27例良性漿膜腔積液中，P16啟動(dòng)子甲基化的頻率為25.9%，RAR-β為37.0%，APC為7.4%；38例惡性漿膜腔積液中P16啟動(dòng)子甲基化的頻率為39.5%，RAR-β為66.7%，APC為28.9%。P16基因和RAR-β基因的甲基化頻率進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。APC基因甲基化頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。良性組中至少兩個(gè)基因啟動(dòng)子甲基化陽性率為7.4%，惡性中陽性率為36.8%，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.370,P=0.007)，見表3。對(duì)基因進(jìn)行兩兩分析，良性組中P16和RAR-β基因啟動(dòng)子同時(shí)甲基化的頻率為7.4%，不存在RAR-β和APC基因啟動(dòng)子同時(shí)陽性，與惡性組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

A:P16為150 bp；B：RAR-β為150 bp；C：APC為100 bp。啟動(dòng)子CG島進(jìn)行甲基化特異度PCR(MSP)擴(kuò)增后行1.5%瓊脂糖電泳，Marker為100 bp ladder。M：甲基化基因；U：未甲基化基因。NC為陰性對(duì)照，PC為陽性對(duì)照，3個(gè)基因均在 65號(hào)樣本中進(jìn)行MSP檢測(cè)

圖1啟動(dòng)子CG島甲基化PCR后電泳圖

表2 不同組中單基因的甲基化情況[n(%)]

M：甲基化基因；U：未甲基化基因

在65例樣本行脫落細(xì)胞學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)27例臨床綜合診斷為良性疾病的樣本中可疑陽性1例，細(xì)胞學(xué)陽性1例；38例惡性漿膜腔積液中陽性診斷26例，可疑3例。脫落細(xì)胞聯(lián)合各基因即脫落細(xì)胞和甲基化檢測(cè)有1個(gè)為陽性，聯(lián)合任意基因進(jìn)行良惡性胸腔積液的鑒定，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

表3 不同組的甲基化狀態(tài)[n(%)]

2.3P16、RAR-β和APC 3基因啟動(dòng)子甲基化診斷良惡性漿膜腔積液的靈敏度和特異度 單獨(dú)甲基化檢測(cè)方面發(fā)現(xiàn)至少兩個(gè)基因發(fā)生甲基化的靈敏度為36.8%，特異度為92.6%，陽性預(yù)測(cè)值為87.5%，陰性預(yù)測(cè)值為51.0%，其中RAR-β、APC同時(shí)甲基化的特異度為100.0%。脫落細(xì)胞聯(lián)合甲基化檢測(cè)后靈敏度普遍升高，但特異度降低，見表6。

表4 兩基因啟動(dòng)子甲基化陽性的數(shù)目[n(%)]

表5 脫落細(xì)胞學(xué)聯(lián)合各基因啟動(dòng)子甲基化分析在不同積液中的頻數(shù)(n)

M：甲基化基因；U：未甲基化基因

表6 不同基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)對(duì)診斷良惡性漿膜腔積液的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分析(%)

3 討 論

1993年SERRANO等[7]首次克隆得到的編碼腫瘤抑制蛋白P16的cDNA，從那時(shí)起P16基因就經(jīng)常應(yīng)用于腫瘤研究領(lǐng)域。P16基因?qū)儆谥芷谝蕾囆约っ敢种埔蜃?CDK1) 基因家族，位于染色體9p21，其蛋白產(chǎn)物調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡，阻止DNA損傷的細(xì)胞進(jìn)行分裂增殖[8]。近年來，有研究表明P16基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化，會(huì)導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄終止，引起基因失活[9]。P16基因可以通過與細(xì)胞周期蛋白D1結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)性抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4/6(CDK4、CDK6)的活性，從而降低 Rb蛋白的磷酸化程度，抑制轉(zhuǎn)錄因子E2F的釋放，阻止細(xì)胞從G0期進(jìn)入S期，抑制細(xì)胞增殖[10]。P16基因表達(dá)下調(diào)或失活的情況下很有可能引起細(xì)胞異常分裂增殖、最終生長失去控制，導(dǎo)致細(xì)胞惡性變[8]。本研究發(fā)現(xiàn)P16基因在惡性漿膜腔積液中的甲基化率為39.5%，在良性漿膜腔積液中的甲基化率為25.9%，惡性積液中的甲基化率高于良性組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與LIU等[5]的研究結(jié)果有一定的差異，可能是由于本試驗(yàn)中樣本為漿膜腔積液而劉大鷹等的研究則為單純的胸腔積液；但本試驗(yàn)結(jié)果顯示出的惡性和良性組間的差異趨勢(shì)與以往的研究相同。

RAR-β基因，又稱為核受體亞家族1，B群，2組(nuclear receptor subfamily 1,group B,member 2，NR1B2)。RAR-β蛋白與維生素A的生物活性形式視黃酸結(jié)合介導(dǎo)胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化過程中的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。HUA等[11]分析表明與自體對(duì)照RAR-β啟動(dòng)子在小細(xì)胞肺癌組織中高甲基化，因此RAR-β可以成為診斷小細(xì)胞肺癌的潛在診斷指標(biāo)。

APC基因，位于5q22.2，是一種抑癌基因[12]。APC蛋白可以抑制β連環(huán)蛋白的濃度，與E-鈣黏蛋白相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附功能。APC基因突變可能會(huì)引起結(jié)直腸癌的發(fā)生[13]。研究表明，在胃腸道癌癥，肺癌和乳腺癌中APC基因1A啟動(dòng)子發(fā)生甲基化和基因的沉默表達(dá)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)APC基因在良性組中的甲基化頻率為7.4%，惡性中的甲基化頻率為28.9%，兩組中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)其診斷的特異度較高，達(dá)到92.6%，陽性預(yù)測(cè)值為84.6%，表明該基因陽性時(shí)，漿膜腔積液為惡性的可能性較大。

本研究顯示RAR-β在惡性漿膜腔積液中的甲基化頻率為66.7%，良性的甲基化頻率為37.0%。RAR-β和APC同時(shí)陽性診斷惡性漿膜腔積液的特異度為100.0%，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同樣統(tǒng)計(jì)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)3基因至少兩個(gè)基因發(fā)生甲基化及P16和(或)RAR-β啟動(dòng)子發(fā)生甲基化在良性和惡性腫瘤中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。脫落細(xì)胞學(xué)聯(lián)合甲基化基因檢測(cè)可以提高診斷的靈敏度，但特異度降低，但用兩種方式聯(lián)合區(qū)分惡性和良性漿膜腔積液的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中脫落細(xì)胞學(xué)聯(lián)合APC甲基化陽性或聯(lián)合至少兩基因陽性具有較高的診斷靈敏度和特異度。因此，漿膜腔積液P16、RAR-β和APC基因甲基化聯(lián)合脫落細(xì)胞學(xué)檢查對(duì)良、惡性漿膜腔積液有鑒別診斷價(jià)值。

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