PD-L1在人膠質瘤中的表達及其對腫瘤內浸潤性T細胞凋亡的影響*

李巧轉,李 嫻

(1.解放軍第101醫院病理科,江蘇無錫 214044；2.重慶醫科大學病理教研室 400016)

膠質瘤是十分常見的中樞神經系統腫瘤，惡性度高，患者生存率低。程序性死亡受體-1(programmed death-1,PD-1)是免疫球蛋白家族的一種膜蛋白，在繼發感染中對免疫介導的組織損傷有重要的保護作用，它包含程序性死亡-配體1(PD-L1)和程序性死亡-配體2(PD-L2)兩種抑制性配體。研究表明，PD-L1在非小細胞肺癌、卵巢癌、腎細胞癌等眾多腫瘤高表達[1-3]。本實驗采用免疫組織化學法觀察PD-1/PD-L1在人膠質瘤組織中的表達，分析其與臨床病理特征相關性。TUNEL法檢測膠質瘤內浸潤性淋巴細胞的凋亡，流式細胞術分析PD-L1促進膠質瘤患者外周血中活化T細胞的凋亡情況，為膠質瘤免疫治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 正常腦組織18例選自腦外傷腦出血患者，膠質瘤組織80例均取自解放軍第101醫院病理科2007-2011年的病理標本，術前未經化療、放療與激素治療，病理診斷明確且有完整的臨床病理資料，均取得知情同意。其中男45例，女35例，年齡6～75歲，平均(47.5±5.4)歲。根據WHO中樞神經系統腫瘤分型(2011年版)進行分級，Ⅰ級3例，Ⅱ級24例，Ⅲ級20例，Ⅳ級33例。病例資料的隨訪通過電話和戶籍查訪兩種方法進行，隨訪時間大于或等于60個月，隨訪成功54例(67.5%)。膠質瘤患者外周血選取術后確診在院的膠質瘤Ⅳ級患者(因Ⅳ級患者PD-L1的表達率高)，均取得患者及家屬同意。

1.2方法

1.2.1試劑 一抗PD-1(克隆號UMAB199)，PD-L1(克隆號UMAB228)，PD-L2(克隆號UMAB223),CD3(克隆號UMAB54)和二抗檢測試劑PV8000均購自無錫傲銳東源生物科技有限公司。

1.2.2免疫組織化學方法 采用的10%中性甲醛固定石蠟包埋組織，4 μm脫蠟水化組織切片，熱修復后磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，放置H2O2中孵育15 min，滴加一抗孵育過夜(4 ℃)，二抗室溫孵育30 min后經二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木精復染。免疫組織化學結果判斷：(1)首先用光學顯微鏡進行觀察，PD-L1、PD-1主要定位于膠質瘤細胞質或細胞膜，陽性染色為細胞質出現黃色或者褐色顆粒，呈彌漫性分布；(2)在400倍視野下，避開出血和壞死區域，選取具有代表性的腫瘤區域，隨機選擇10個視野，計數500～1 000個細胞，計算每個病例的腫瘤細胞陽性率；(3)腫瘤細胞陽性率評分：<1%為0分；1%～<10%為1分；10%～<50%為2分；50%～<75%為3分；≥75%為4分；(4)同時根據染色強度進行記分：無染色0分；淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；(5)最后根據腫瘤細胞陽性率和染色程度進行評分相加：0～3分為低表達，4～7分為高表達。

1.2.3TUNEL法檢測淋巴細胞凋亡 切片脫蠟并經抗原修復及PBS洗滌后H2O2中孵育20 min，清洗后滴加50 μL末端脫氧核糖酸轉移酶(TdT)反應液常溫孵育1 h，洗滌后滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素(Streptavidin-HRP)遮光孵育25 min，DAB顯色蘇木素復染封片，陰性對照以PBS代替TdT。

1.2.4流式細胞術檢測淋巴細胞凋亡 分別收集5例健康和膠質瘤Ⅳ級患者的抗凝新鮮外周血，梯度離心提取單個核細胞后經尼龍毛獲得T淋巴細胞。經過聚羥基脂肪酸酯(PHA)活化的T細胞接種于24孔板，每孔500 μL×106個/mL，培養24 h后分為空白組(加入PBS)、拮抗組(抗PD-1+ PD-L1)和實驗組(加PD-L1)共培養48 h，收集T細胞，經異硫氰酸熒光素標記的膜聯蛋白V(Annexin V-FITC)避光孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

2 結 果

2.1免疫組織化學檢測PD-L1在膠質瘤組織中蛋白表達 結果顯示：PD-L1主要定位在腫瘤細胞的細胞質或細胞膜，呈棕黃色著色PD-L1在人正常膠質細胞不表達，在部分膠質瘤中陽性表達42.50%(34/80)，見圖1。

A:正常神經膠質細胞不表達PD-L1;B:膠質瘤低表達PD-L1;C:膠質瘤高表達PD-L1

圖1免疫組織化學檢測PD-L1在正常膠質細胞、膠質瘤組織的低表達及高表達(×200)

2.2PD-L1與膠質瘤臨床病理因素之間的相關性分析 實驗對膠質瘤PD-L1的表達與腫瘤位置、大小、有無壞死及臨床病理分期及年齡等進行相關性分析，結果顯示，病理分級越高，PD-L1的表達水平越高(P<0.01)；PD-L1表達與和膠質瘤分級相關的壞死有關，而與患者的年齡、性別、腫瘤位置、大小無關，見表1、2。

表1 PD-L1在80例膠質瘤組織中的表達與臨床病理特征(n)

表2 80例膠質瘤患者在不同影響因素下PD-L1表達可信區間分析

2.3PD-L1的表達與患者的預后關系 按照材料與方法中的分類說明，將PD-L1在膠質瘤中的表達分為低表達組(評分0～3分)和高表達組(評分4～7分)。進行Kaplan-Meier生存分析發現：PD-L1低表達組患者5年生存率明顯高于PD-L1高表達組的患者(P<0.05)，見表3、圖2。

表3 54例膠質瘤隨訪成功患者PD-L1表達5年生存率

圖2 PD-L1在膠質瘤組織中Kaplan-Meier生存曲線分析結果

2.4膠質瘤局部浸潤的淋巴細胞表達PD-1并出現凋亡 免疫組織化學染色顯示膠質瘤Ⅳ級瘤組織內浸潤的部分淋巴細胞表達PD-1。TUNEL法檢測結果顯示PD-L1強陽性的病例中膠質瘤組織內浸潤的淋巴細胞出現凋亡，然而PD-L1陰性的膠質瘤病例瘤組織內淋巴細胞凋亡數少，見圖3。

圖3 免疫組織化學檢測膠質瘤Ⅳ級局部浸潤淋巴細胞出現凋亡(TUNEL×200)

圖4 PD-L1對外周血活化T細胞凋亡的影響

2.5PD-L1對患者外周血活化T細胞凋亡的影響 流式細胞結果顯示重組人PD-L1與健康或膠質瘤患者外周血活化的T細胞共培養后，重組人PD-L1組的凋亡率為42.55%，明顯高于空白對照組，加入抗PD-1阻斷PD-L1與T淋巴細胞結合后，PD-L1+抗PD-1組T淋巴細胞凋亡率下降至26.80%，見圖4。

3 討 論

惡性膠質瘤患者復發率高、預后較差，迄今為止，膠質瘤局部微環境調節其侵襲性、增殖、凋亡等生物學異常行為的具體分子機制仍不清楚[4]。因此，闡明惡性膠質瘤細胞凋亡發生的分子機制，對膠質瘤的治療及其預后有著重要的意義。

研究發現PD-L1可以獨立作為胰腺癌患者預后評價的指標；同時在胃癌患者，高表達PD-L1患者臨床分期晚，病理分化差[5-6]，PD-L1高表達病例其腫瘤擴散指數ki-67表達也上調，腫瘤細胞培養中運用阻斷劑下調PD-L1后腫瘤細胞的轉移與復發也程相對靜止狀態[7-8]。在非小細胞肺癌中，PD-L1在腫瘤細胞及腫瘤間質與淋巴細胞表達成正相關，也與臨床分期及預后呈正相關[9]。這都提示阻斷PD-L1可能是腫瘤免疫治療的有效手段。本研究檢測了80例膠質瘤石蠟切片中PD-L1的表達，結果發現膠質瘤各級別之間PD-L1的表達差異有統計學意義(P<0.05)，PD-L1的表達隨膠質瘤級別的增高而增高，進一步的隨訪顯示膠質瘤高表達PD-L1的患者5年生存率較低[10-11]。

在機體的免疫應答過程中，T細胞是適應性免疫的生發中心。T細胞在靜息狀態下低表達PD-1，而T細胞的激活引起PD-1的表達上調。本研究表明膠質瘤中浸潤性淋巴細胞部分表達PD-1，同時TNUEL實驗結果顯示高表達PD-L1組膠質瘤內浸潤性淋巴細胞凋亡明顯，流式細胞結果也顯示PD-L1+抗PD-1組T細胞的凋亡率明顯下降，PD-L1蛋白促進膠質瘤外周血活化T細胞的凋亡，這提示了膠質瘤高表達的PD-L1與淋巴細胞表達的PD-1結合促進淋巴細胞的凋亡，進而抑制抗腫瘤免疫功能。這可能與T細胞跨膜受體PD-1與配體PD-L1結合后，其碳端結構域磷酸化繼而去磷酸化其下游因子磷脂酰3激酶和脾酪氨酸激酶，進而抑制T細胞活化，誘導T細胞凋亡[12-13]有關。

綜上所述，人膠質瘤組織異常高表達PD-L1，且與病理分級和患者預后密切相關，PD-L1與PD-1結合促進腫瘤內浸潤的T淋巴細胞的凋亡，因此PD-1/ PD-L1信號通路有望成為膠質瘤免疫治療的靶點之一。

[1]PADDA S K,RIESS J W,SCHWARTZ E J,et al.Diffuse high intensity PD-L1 staining in thymic epithelial tumors[J].J Thorac Oncol,2015,10(3):500-508.

[2]KATSUYA Y,FUJITA Y,HORINOUCHI H,et al.Immunohistochemical status of PD-L1 in thymoma and thymic carcinoma[J].Lung Cancer,2015,88(2):154-159.

[3]SCHULTHEIS A M,SCHEEL A H,OZRETIC L,et al.PD-L1 expression in small cell neuroendocrine carcinomas[J].Eur J Cancer,2015,51(3):421-426.

[4] YIN B J,LI Z Y,YU S B,et al.The roles of mTNF-α and sTNF-α in endotoxin shock[J].Chin J Microbiol Immunol,2002.

[5]GADIOT J,HOOIJKAAS A I,KAISER A D,et al.Overall survival and PD-L1 expression in metastasized malignant melanoma[J].Cancer,2011,117(10):2192-2201.

[6]WANGLC,MAQY,CHENXL,etal.

Clinical significance of B7-H1 and B7-1 expressions in pancreatic carcinoma[J].World J Surg,2010,34(5):1059-1065.

[7]SENDUR M A,AKSOY S,DEMIRCI S,et al.Can targeted programmed death-1 antibody be a new treatment approach in breast cancer[J].J BUON,2014,19(2):584-590.

[8]GHEBEH H,TULBAH A,MOHAMMED S,et al.Expression of B7-H1 in breast cancer patients is strongly associated with high proliferative Ki-67-expressing tumor cells[J].Int J Cancer,2007,121(4):751-758.

[9]馬薇，羅殿中，陳源，等．PDLI和PD-I在非小細胞肺癌中的表達及其臨床意義[J]．實用醫學雜志，2011，27(9)：1551-1554．

[10]KERR K M,TSAO M S,NICHOLSON A G,et al.Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry in Lung Cancer:In what state is this art?[J].J Thoracic Oncol,2015,10(7):985-989.

[11]CIMINO-MATHEWS A,THOMPSON E,TAUBE J M,et al.PD-L1(B7-H1) expression and the immune tumor microenvironment in primary and metastatic breast carcinomas[J].Hum Pathol,2016,47(1):52-63.

[12]SUN H Y,SUN C,XIAO W H.Expression regulation of co-inhibitory molecules on human natural killer cells in response to cytokine stimulations[J].Cytokine,2014,65(1):33-41.

[13]VASSILIKI A M,PRANAM C.Biochemical signaling of PD-1 on T cells and its functional implications[J].Cancer J,2004,34(2):167-175.