寧夏地區(qū)高血壓腎損害患者腫瘤壞死因子-α-308基因多態(tài)性及其與貝那普利治療反應(yīng)的相關(guān)性研究*

于 欣，于美玲，張德凱，楚元奎，張怡清，白 靜，邢譯文，楊 震

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床學(xué)院檢驗(yàn)系，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院藥劑科，銀川 750004;3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心臟中心，銀川 750004)

高血壓病是全球范圍內(nèi)的多發(fā)病和常見(jiàn)病。據(jù)報(bào)道2002年中國(guó)全民高血壓發(fā)病率為18.8%[1]。近期的一項(xiàng)多中心研究顯示，20歲以上的人群中，男性高血壓發(fā)病率為30.09%，女性為24.79%[2]，總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。

除了心、腦、眼以外，腎臟也是高血壓重要的靶器官之一。長(zhǎng)期高血壓能夠?qū)е履I功能不全、腎衰竭，是慢性腎病(chronic kidney disease,CKD)的主要原因之一[3]。我國(guó)原發(fā)性高血壓病患者約1億人，其中10%～15%將進(jìn)展至慢性腎衰竭，并最終依靠透析治療維持生存，給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。鑒于高血壓所致腎損害危害巨大，開(kāi)展預(yù)測(cè)和早期防治具有非常重要的意義。

24 h尿蛋白排泄率可以作為識(shí)別高血壓腎損害以及評(píng)估降壓藥物治療反應(yīng)的指標(biāo)[4-5]，本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)高血壓腎損害患者的血清白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平高于單純高血壓組[6]，提示激活的炎性反應(yīng)可能參與了高血壓腎損害的發(fā)生、發(fā)展。高血壓腎損害的發(fā)生有著一定的個(gè)體差異，而TNF-α與高血壓腎損害相關(guān)，本研究檢測(cè)了寧夏地區(qū)高血壓病及高血壓腎損害患者TNF-α水平及TNF-α-308基因多態(tài)性，以探討TNF-α及其基因多態(tài)性與本地區(qū)高血壓病及高血壓腎損害的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年1月至2016年1月于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院就診的初診為高血壓病的患者284例，依據(jù)尿蛋白排泄率結(jié)果分為單純高血壓組(尿蛋白排泄率小于20 μg/min，n=152)和高血壓腎損害組(尿蛋白排泄率大于或等于20 μg/min，n=132)，同時(shí)選取160例健康體檢者作為正常對(duì)照組。高血壓病的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：收縮壓大于或等于140 mm Hg,和/或舒張壓大于或等于90 mm Hg,并排除繼發(fā)性高血壓。高血壓腎損害的診斷：24 h尿蛋白排泄率大于或等于20 μg/min。對(duì)所有入選患者行尿蛋白排泄率檢測(cè)以確定高血壓腎損害者，同時(shí)排除禁忌證后在降壓藥物中選擇貝那普利(10 mg，1次/d，服藥時(shí)間為8:00-10:00)，若對(duì)貝那普利有禁忌證或咳嗽顯著可用血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑代替，并根據(jù)患者情況在貝那普利基礎(chǔ)上酌情聯(lián)合其他降壓藥。16周后復(fù)查血漿TNF-α及尿蛋白排泄率，以此評(píng)價(jià)貝那普利的療效。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集和儲(chǔ)存 抽取患者清晨空腹靜脈血于含枸椽酸鈉抗凝劑(1∶9)的采血管中。4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取血漿分裝于0.5 mL EP管中，-80 ℃低溫冰箱中保存，以最后統(tǒng)一測(cè)定血漿各項(xiàng)指標(biāo)。吸取白細(xì)胞層置于15 mL離心管中，加入紅細(xì)胞裂解液，顛倒混勻，室溫放置15 min。于4 ℃、3 000 r/min離心20 min，棄去上清液，再將白細(xì)胞沉淀置于-20 ℃冰箱保存以行DNA提取。

1.2.224 h尿蛋白排泄率測(cè)定 入選患者留取2次(間隔1周以上)24 h尿標(biāo)本(7:00至次日7:00)，測(cè)定總量后取5 mL，離心，取上清液置于-80 ℃冰箱凍存，最后統(tǒng)一用放射免疫法測(cè)定尿白蛋白，然后計(jì)算出24 h尿蛋白排泄率(μg/min)。

1.2.3實(shí)驗(yàn)試劑 放射免疫試劑盒(上海西唐生物技術(shù)公司)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(上海力康公司)，PCR試劑盒(上海西唐生物技術(shù)公司)，PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems)。

1.2.4血漿TNF-α水平的測(cè)定 采用ELISA，具體方法按說(shuō)明書(shū)(IL-6 ELISA試劑盒，美國(guó)RB公司)進(jìn)行。

1.2.5TNF-α基因多態(tài)性檢測(cè)

1.2.5.1模版DNA制備 在白細(xì)胞沉淀管中加入3 mL核裂解液[10.0 mmol/L Tris、0.4 mol/L NaCl、2.0 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)，pH 8.2]，充分混勻并懸浮白細(xì)胞，然后向每管中加入0.8 mL蛋白酶K溶液(2 mg/mL)與0.2 mL 10% SDS混合液，顛倒混勻，置于37 ℃過(guò)夜。次日晨取出離心管，如溶液澄清，加入飽和NaCl 1 mL，混勻15 s，3 000 r/min離心15 min。取含DNA的上清倒入另一離心管中，加入兩倍體積(約8 mL)的無(wú)水乙醇，輕輕顛倒混勻至DNA析出并漂浮于液面，用無(wú)菌Tip頭小心將DNA撈出，并移至EP管中，室溫下待乙醇蒸發(fā)干凈后加入TE(10.0 mmol/L Tris，pH 7.6，1.0 mmol/L Na2EDTA)50～150 μL，置于4 ℃保存，待DNA完全溶解后移至-20 ℃保存?zhèn)溆茫瑫r(shí)取部分于紫外分光光度計(jì)下測(cè)定DNA水平。基因型測(cè)定采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性基因分析方法(PCR-RELP法)檢測(cè)。

1.2.5.2引物設(shè)計(jì) Forward:5′-AGGCA ATAGG TTTTG AGGGC CAT-3′；Reverse:5′-ACACT CCCCA TCCTC CCTGCT-3′。PCR擴(kuò)增體系:預(yù)變性94 ℃ 3 min，94 ℃變性60 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸120 s，35次循環(huán)，完成后再于72 ℃延伸5 min。在 20 μL的酶切體系中，TNF-α-308位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL用5 U msP1內(nèi)切酶在 37 ℃酶切1.5 h。聚丙烯酞胺凝膠電泳分離后，用1%溴化乙錠浸染30 min，使用凝膠成像及分析系統(tǒng)判斷結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1一般資料結(jié)果 正常血壓組、高血壓組和高血壓腎損害組之間年齡、性別構(gòu)成、BMI、三酰甘油比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高血壓組和高血壓腎損害組的收縮壓、舒張壓、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇高于正常血壓組(P<0.05)。高血壓組和高血壓腎損害組的TNF-α水平較正常血壓組高，且高血壓腎損害組高于高血壓組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 一般資料比較

a:P<0.05,與正常血壓組比較；b:P<0.05,與高血壓組比較

2.2TNF-α-308基因多態(tài)性分布 遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)照組、高血壓組和高血壓腎損害組TNF-α-308基因的多態(tài)位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。在寧夏地區(qū)健康人群中，以AA基因型最為多見(jiàn)，其次依次為GA和GG，G/A等位基因頻率分別為32%/68%；高血壓組患者的TNF-α-308的基因型以GA為多見(jiàn)，其次為GG、AA，G/A等位基因頻率分別為53%/47%；高血壓腎損害患者的TNF-α-308的基因型以GG最為多見(jiàn)，其次為GA和AA，G/A等位基因頻率分別為70%/30%。基因型及G/A等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示G等位基因頻率與寧夏地區(qū)高血壓腎損害相關(guān)，見(jiàn)表2。

表2 各組間TNF-α-308基因多態(tài)性比較[n(%)]

3組基因型比較，χ2=57.313，P<0.01；兩組等位基因頻率比較，χ2=80.206，P<0.01

2.3不同基因型間臨床特征的比較 高血壓腎損害患者的TNF-α-308的3種基因型GG、GA、AA中，GG基因型患者的低密度脂蛋白膽固醇和TNF-α水平較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示GG基因型與低密度脂蛋白膽固醇血癥和TNF-α相關(guān)，見(jiàn)表3。

表3 高血壓腎損害患者TNF-α-308的3種基因型的臨床特征比較

2.4不同TNF-α-308基因型高血壓腎損害患者對(duì)貝那普利治療的反應(yīng) 高血壓腎損害組中TNF-α-308各基因型患者在β受體阻滯劑、利尿劑、鈣拮抗劑的使用比例，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4。對(duì)132例高血壓腎損害患者予以貝那普利10 mg/d治療16周后，AA基因型的治療前后尿蛋白排泄率和TNF-α的改變幅度最大，其次是GA和GG基因型，3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而三組間血壓下降幅度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表5。

表4 高血壓腎損害組中TNF-α-308各基因型降壓藥物組成比較[n(%)]

表5 TNF-α-308不同基因型高血壓腎損害患者貝那普利治療反應(yīng)比較

△收縮壓/舒張壓(mm Hg)=貝那普利治療前收縮壓/舒張壓(mm Hg)-貝那普利治療后收縮壓/舒張壓(mm Hg)；△尿蛋白排泄率(μg/min)=貝那普利治療前尿蛋白排泄率(μg/min)-貝那普利治療后尿蛋白排泄率(μg/min)；△TNF-α=貝那普利治療前TNF-α(ng/mL)-貝那普利治療后TNF-α(ng/mL)

3 討 論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，寧夏地區(qū)單純高血壓組和高血壓腎損害組之間TNF-α-308的基因型有差異，高血壓腎損害組的GG型頻率高于單純高血壓組，提示高血壓腎損害發(fā)生與炎癥因子的基因多態(tài)性相關(guān)。

腎損害是高血壓重要的靶器官損害，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)高血壓腎損害與免疫和炎癥相關(guān)[7-8]，而TNF-α抑制劑及TNF-α中和治療可減緩鹽敏感型高血壓腎損害的進(jìn)展[9]，減輕腎臟的炎性反應(yīng)和纖維化[10]。本課題組在前期研究中也發(fā)現(xiàn)高血壓腎損害患者的血清TNF-α水平高于單純高血壓組[11]，提示激活的炎性反應(yīng)可能參與了高血壓腎損害的發(fā)生、發(fā)展。

高血壓腎損害的發(fā)生具有個(gè)體差異性，受到多種因素的影響，除血壓外，還受遺傳異質(zhì)性的影響。本研究結(jié)果提示，在遺傳異質(zhì)性當(dāng)中，TNF-α-308的多態(tài)性也是其中的重要表現(xiàn)。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)高血壓腎損害組的TNF-α水平升高[11]，提示TNF-α-308的基因多態(tài)性變化可能使得炎癥因子的水平不同，從而出現(xiàn)不同程度的腎臟損害，這可能是TNF-α-308基因多態(tài)性與高血壓腎損害相關(guān)性的機(jī)制所在。由于高血壓腎損害的發(fā)生與TNF-α-308基因多態(tài)性相關(guān)，那么就可以通過(guò)檢測(cè)患者的基因多態(tài)性來(lái)預(yù)測(cè)腎損害發(fā)生的可能性和風(fēng)險(xiǎn)性，在選擇降壓藥物的時(shí)候，就可以優(yōu)先選擇對(duì)腎臟有保護(hù)作用的藥物如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑或血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑類藥物。

本研究還探討了TNF-α-308基因型與高血壓腎損害患者對(duì)貝那普利治療的反應(yīng)性之間的關(guān)聯(lián)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-α-308的AA基因型患者對(duì)貝那普利治療的反應(yīng)最佳，治療前后尿蛋白排泄率和TNF-α的改變幅度最大，其次是GA和GG基因型，且這種作用獨(dú)立于降壓作用之外。說(shuō)明高血壓腎損害患者對(duì)貝那普利治療的反應(yīng)性與TNF-α-308的基因型有關(guān)，通過(guò)檢測(cè)高血壓腎損害患者的TNF-α-308的基因型可以預(yù)測(cè)患者對(duì)貝那普利的治療效果，對(duì)于高血壓腎損害患者選擇合適的治療藥物具有更進(jìn)一步的參考和指導(dǎo)價(jià)值。

綜上所述，高血壓腎損害及其對(duì)貝那普利治療的反應(yīng)與TNF-α-308基因的多態(tài)性相關(guān)，通過(guò)檢測(cè)高血壓患者的TNF-α-308基因多態(tài)性，可以預(yù)測(cè)高血壓腎損害的發(fā)生，并可預(yù)測(cè)對(duì)貝那普利治療的反應(yīng)和效果，對(duì)臨床治療具有一定的參考價(jià)值。

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