野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠血清中瘦素和肺組織中瘦素受體的表達及意義*

錢天賜，彭星星，梁先柱，阮富貴，孫江濱，王海永△

(1.桂林醫學院附屬醫院心血管外科，廣西桂林 541001；2.桂林醫學院第二附屬醫院心胸外科，廣西桂林 541001)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)是由于轉化生長因子-β(TGF-β)、氧化應激、炎性反應等因素使得肺動脈壓力升高，并超過一定界值的血流動力學狀態[1]，其主要的病理變化是血管內膜增生、非肌型血管肌化和肌型血管增厚。瘦素是肥胖基因編碼的一個相對分子質量為16×103的非糖基化蛋白類激素，一直以來被認為是抑制肥胖的主要物質。最近研究發現，瘦素不僅能夠促進炎性反應，而且還可以促進血管平滑肌細胞的增殖和遷移[2-3]。但瘦素在PAH發病過程中的變化規律卻很少報道，本研究以野百合堿(monocrotaline,MCT)誘導的PAH大鼠模型為研究對象，觀察瘦素及其受體(leptin receptor,OB-R)的表達情況，并初步判斷其與PAH的關系。

1 材料與方法

1.1材料 選擇健康雄性SD大鼠15只(購于桂林醫學院實驗動物中心)，體質量200～260 g，將其分為對照組(n=5)和實驗組(n=10)，其中實驗組又分為實驗組一(n=5)與實驗組二(n=5)。本實驗符合桂林醫學院動物倫理委員會的相關規定。

1.2方法

1.2.1實驗動物模型的建立 實驗組大鼠按照60 mg/kg劑量在腹腔注射1% MCT溶液(無水乙醇與生理鹽水以1∶4混合作為溶劑)，在對照組大鼠腹腔注射無水乙醇與生理鹽水1∶4混合液。

1.2.2測量平均肺動脈壓、右心室肥厚指數及標本的收集 實驗組一與實驗組二大鼠在注射MCT后，分別于第2、4周經腹腔注射2%戊巴比妥鈉(3 mL/kg)麻醉，抽取靜脈血2 mL，4 ℃靜置，以3 000 r/min離心10 min，取上清液并于-80 ℃冰箱凍存待測。使用聚乙烯導管緩慢通過右側頸靜脈進入肺動脈，再用生理多導監測儀分別記錄平均肺動脈壓(mean pulmonary artery pressure,mPAP)。開胸收集肺組織以備實驗使用，同時分離右心室、左心室和室間隔，并稱其質量，計算出右心室肥厚指數(right ventricular hypertrophy index,RVHI)，即右心室游離壁/(左心室+室間隔)。對照組在第4周測量mPAP，其余處理同實驗組。

1.2.3蘇木精-伊紅(HE)染色方法 將標本在10%甲醛中固定后，用石蠟包埋，將肺組織制作成4 μm病理切片，然后各組取兩張切片進行HE常規染色，觀察大鼠肺動脈的形態學變化情況。

1.2.4血清瘦素檢測 采用ELISA檢測外周血中瘦素，試劑盒購自上海一基實業有限公司，按說明書具體步驟操作，測定吸光度，由標準曲線計算血清瘦素水平。

1.2.5Western blot測OB-R表達 將100 mg肺組織用剪刀剪碎后置于4 mL EP管中，加入2 mL的RIPA蛋白裂解液，用研磨棒研磨3 min，將EP管置于超聲儀下裂解組織，4 ℃離心機12 000 r/min離心15 min。取上清液置于EP管中，用二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白水平。取出400 μg總蛋白，加入上樣緩沖液，煮沸后取出20 μL蛋白，用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳1.5 h，蛋白質轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶37 ℃封閉1 h，TBST洗膜3次，加入Abcam公司的OB-R一抗孵育，4 ℃過夜；次日，加入二抗，室溫孵育1 h，洗膜后加電化學發光(ECL)液顯影，掃描儀中成像。運用Image Lab軟件分析各組Western blot條帶，計算灰度值。

2 結 果

2.1大鼠血流動力學變化和右心肥厚指標 實驗組大鼠mPAP及RVHI顯著增加，且隨MCT注射時間的延長而逐漸升高，各組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 3組大鼠mPAP和RVHI的比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與實驗組一比較

2.2HE染色結果 光鏡下觀察可見，對照組肺組織的中小動脈壁未見增厚，肺泡腔內結構完整，有少量炎性細胞浸潤；實驗組大鼠的肺中小動脈平滑肌細胞明顯增生、肥大，血管壁不規則增厚，管腔狹窄，甚至閉塞，肺組織中可見較多炎性細胞浸潤，見圖1。

A：對照組；B：實驗組一；C：實驗組二

圖1對照組和實驗組肺組織HE染色(×200)

表2 OB-R的灰度值和血清瘦素水平

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與實驗組一比較

A：對照組；B：實驗組一；C：實驗組二

圖2對照組和實驗組肺組織中OB-R的表達

2.3各組血清中瘦素水平變化的比較 與對照組比較，實驗組的血清瘦素水平均升高，且隨著MCT注射時間的延長，血清中瘦素水平也逐步增高，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.4肺組織中OB-R的表達水平 與對照組相比，實驗組肺組織中OB-R的表達水平均增高(P<0.05)，且隨MCT注射時間的延長而升高，受體蛋白的表達水平在實驗組二的肺組織中最高，見表2、圖2。

2.5相關性分析 大鼠血清中瘦素和肺組織中OB-R與mPAP均呈正相關(r=0.912,P<0.05；r=0.861,P<0.05)。

3 討 論

PAH是伴有肺血流增多的先天性心臟病(簡稱先心病)常見的并發癥，進行性肺血流增多導致肺血管重塑，最終發展為艾森曼格綜合征。JING等[4]報道先心病繼發PAH患兒生存率明顯低于成人。由于我國未經治療的先心病患兒的數量已有200萬例，而且每年至少增加15萬例[5]，因此，一旦病情發展到PAH階段，將給其家庭和社會帶來巨大的經濟負擔。目前，對于先心病繼發PAH的治療主要以血管活性藥物為主，療效得到了一定認可，但卻不能減緩或逆轉肺血管重塑，也不能降低病死率。因此，如何抑制肺血管平滑肌增殖已經成為新的研究熱點。

在PAH的相關研究中，MCT是經常使用的一種誘導劑，它主要是在豬屎豆的種子和葉子中提取，其代謝產物具有多器官毒性。MCT能夠誘導大鼠肺動脈內皮損傷，從而導致肺組織水腫、肺動脈中膜增厚等病理變化[6]。本研究HE染色結果發現，實驗組大鼠肺動脈中膜較對照組肌化明顯，與GEORGE等[6]報道的結果一致；同時，mPAP及RVHI隨著MCT誘導的時間延長而呈進行性升高，這也間接反映了肺動脈的阻塞程度，說明本研究的PAH動物模型已成功建立。

瘦素是一種多靶器官、功能廣泛的蛋白激素，具有抑制攝食、增加能量消耗、調節炎性反應、促進纖維化、促上皮細胞和血管生長等作用。最近，瘦素對血管的重塑作用得到較多關注。PAH是以肺血管內皮和平滑肌細胞異常增生為特點的一種肺血管疾病。內皮細胞的異常增殖促進新生血管的形成，產生叢狀損傷，這是其病理變化特點。研究認為在PAH的發生、發展過程中，內皮細胞的損傷可能處于中心環節[7]。瘦素通過激活絲裂素活化蛋白激酶(P38 MAPK)，引起血管內皮細胞增殖，進而影響血管重塑[8]。王先梅等[9]發現，瘦素在體外0～100 ng/mL的劑量范圍內能夠促進內皮細胞和血管平滑肌細胞的增殖。本研究發現，PAH模型大鼠體內的瘦素及OB-R的表達水平顯著升高，且與mPAP呈正相關，這提示瘦素及其受體可能參與PAH發病過程。CHAI等[10]在低氧和MCT誘導的PAH大鼠的研究中也得出類似結論，且還發現瘦素通過細胞外調節蛋白激酶(ERK)、信號傳導及轉錄激活因子(STAT)和蛋白激酶B(AKT)這3條信號轉導通路促進肺動脈血管平滑肌細胞的增殖遷移。盡管PAH的發生、發展過程復雜，但是神經激素系統的激活一直被認為是PAH發病過程中的重要因素之一，尤其是交感神經系統(sympathetic nervous system,SNS)和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)[11]。瘦素不僅能夠激活SNS和RAAS，引起兒茶酚胺、血管緊張素-Ⅱ及醛固酮的釋放增多，還能夠引起一系列的氧化應激反應，這在PAH的發病過程中具有重要意義[12-13]。目前已知，炎癥微環境與PAH的發生和病情進展密切相關。瘦素可以通過誘導內皮細胞第二信使活性氧提高核因子-κB(NF-κB)的活性，引起血管內皮細胞功能紊亂，增加炎性因子的表達[14]。此外，瘦素也可以通過激活NF-κB促進血管平滑肌細胞的增殖和遷移[15]。

綜上所述，瘦素及OB-R的異常升高可能與MCT誘導的大鼠PAH發病有關。本研究提示了一個治療PAH的潛在作用靶點。但是，本研究為體內研究，實驗結果受到多方面因素影響，不能直接反映瘦素及OB-R與PAH的關系，需要進行體外研究加以證實。且由于樣本量少，可能會使實驗結果產生偏倚，期待大樣本量的相關研究。

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