大黃靈仙膠囊調控ABCB11和ABCC2干預膽結石形成的作用機制研究*

唐乾利，呂 震，王 兵，王 宇，王 澍，舒清峰，葛 斌，謝思圳

(1.右江民族醫學院/桂西高發病防治重點實驗室，廣西百色 533000；2.浙江省諸暨市中醫醫院普外科 311800；3.廣西中醫藥大學第一附屬醫院普外科，南寧 530023)

臨床上膽石病的發生機制尚不明確，目前研究多以轉運蛋白的表達改變為主[1]。本課題組前期證實大黃靈仙膠囊可改善小鼠肝膽管側膜細胞轉運蛋白腺苷三磷酸結合盒轉運子B亞族成員11(ATP binding cassette subfamily B member 11，ABCB11)和腺苷三磷酸結合盒轉運體C 亞組2(ATP binding cassette subfamily C member 2，ABCC2)蛋白水平表達降低的病理狀態[2]，但尚未清楚是否因通過調控ABCB11和ABCC2 mRNA轉錄而改變轉運蛋白的表達從而減少膽結石的形成。據此，本研究分析大黃靈仙膠囊對ABCB11和ABCC2轉錄因子mRNA和蛋白表達的調控及協同作用，同時探索其對BSEP/ABCB11和MRP2/ABCC2信號通路上游的干預作用，以期揭示大黃靈仙膠囊防治膽結石的機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器 1-14K高速冷凍離心機(北京五洲東方科技發展有限公司)；Cary 60 UV-Vis紫外可見分光光度計(美國Agilent Technologies公司)；PTC-200普通梯度儀、IQ5實時熒光定量PCR儀(上海伯樂生命醫學產品有限公司)；HPIAS-1000P彩色病理圖文分析系統(同濟千屏影像公司)。

1.1.2藥品與試劑 膽酸(美國Sigma-Aldrich公司，批號：101335972，劑型：粉劑，規格：20 g，純度：98%)；膽固醇(北京索萊寶科技有限公司，批號：527C105，劑型：粉劑，規格：100 g，純度：99%)；總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、熒光定量PCR反應試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(日本TaKaRa Bio Group公司，批號分別為：RR9767、RR047A、RR820A)；兔源性ABCB11一抗、兔源性ABCC2一抗(英國Biorbyt公司，批號分別為：ORB13275、ORB11075)；SV0002-兔酶標抗體兩步法免疫組織化學檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號：10A23C02)。

1.1.3受試藥物 大黃靈仙膠囊(廣西中醫藥大學第一附屬醫院，桂藥監注[2003]88號)，主要成分包括：生大黃、雞內金、威靈仙、金錢草、芒硝、枳殼、澤蘭、柴胡、郁金、磁石、黃芪和甘草，按照廣西壯族自治區藥品監督管理局文件由廣西中醫藥大學第一附屬醫院中心藥房提供標準院內制劑(每顆膠囊含相當于3.75 g生藥)；熊去氧膽酸(廣州Codow有限公司，批號：CD104746；劑型；粉劑；規格：25 g；純度：>98%)。

1.1.4實驗動物 無特殊病原體(SPF)級C57BL/6小鼠40只，雄性，7周齡，體質量18.0～21.0 g，購于南京大學模式動物研究所[動物許可證號：SCXK(蘇)2010-0001]。飼養于右江民族醫學院實驗動物中心，保持12 h∶12 h光/暗周期，溫度為24～26 ℃，相對濕度40%～60%，動物自由進食和飲水。本研究方案經右江民族醫學院動物倫理委員會批準，符合相關倫理學要求。

1.2方法

1.2.1造模及干預方法 將40只小鼠分為4組：正常組(N組)、模型組(M組)、熊去氧膽酸對照組(U組)、大黃靈仙膠囊治療組(D組)，每組各10只。N組小鼠予以普通飼料喂養，M組、U組、D組分別給予高脂、高熱量、高膽固醇(15.0%脂肪、1.0%膽固醇、0.5%膽酸)飼料(致石飼料)喂養8周。同時，U組和D組分別予以熊去氧膽酸和大黃靈仙膠囊干預。藥物劑量根據小鼠與成人體質量等效劑量換算[3]，估算小鼠藥物等效劑量約是60 kg體質量成人的13倍，這與課題組前期實驗量效關系劑量相符[4-6]：熊去氧膽酸用量130 mg·kg-1·d-1，利用等滲鹽水配制干粉溶液，根據小鼠體質量灌胃8周，1次/d；大黃靈仙膠囊灌胃劑量為 13 g·kg-1·d-1(將大黃靈仙膠囊內藥濃煎成相當于含生藥水平為0.65 g/mL的湯藥)，據小鼠體質量灌胃給藥，1次/d，處理8周；N組和M組則分別給予等量體積的等滲鹽水灌胃。肉眼觀察M組小鼠膽囊內有顆粒狀或泥沙狀沉積物，即可判定為造模成功。

1.2.2ABCB11和ABCC2 mRNA水平檢測 ABCB11、ABCC2基因及內參基因GAPDH引物采用Primer 5.0軟件設計，見表1。

表1 目的基因熒光定量PCR引物序列

提取小鼠肝膽管側膜細胞組織總RNA，測定水平后利用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，采用熒光定量PCR反應試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ于IQ5 PCR檢測目的基因mRNA表達水平，PCR擴增后選擇基線，以N組小鼠為校正對象，根據Ct值依次計算基因的相對表達水平，采用2-△△Ct法計算結果。8連管內總體積20 μL的反應液于95 ℃下預變性30 s，1個循環；95 ℃變性5 s，61 ℃延伸30 s，40個循環，55 ℃退火30 s，81個循環。

1.2.3ABCB11和ABCC2 免疫組織化學檢測 將石蠟包埋肝組織切片，通過脫水、去除外源性過氧化物酶、抗原修復、封閉、一抗4 ℃過夜、孵育二抗、二氨基聯苯胺(DAB)顯色、復染、返藍、脫水、透明、封片等步驟后，置于顯微攝像系統上觀察并采集圖片。棕褐色顆粒沉著定為免疫組織化學陽性表現，利用Image J1.8.0_112多功能圖文分析軟件進行定量分析，每張切片取4個高倍鏡視野，測定和分析積分光密度值(IOD值)。

2 結 果

2.1中藥干預藥效評價結果 N組小鼠未見結石，M組及其他組成石小鼠膽囊內可見泥沙樣或顆粒樣沉淀；N組及其他組未成石小鼠膽汁均清亮，呈淡黃色，見圖1。

A:N組膽囊;B:M組膽囊;C:U組膽囊;D:D組膽囊

圖1各組小鼠膽囊結石形成情況

表3 各組小鼠肝膽管側膜細胞ABCB11和ABCC2 mRNA表達水平比較

a：P<0.01，與N組比較；b：P<0.01，與M組比較

2.2各組小鼠肝膽管側膜細胞ABCB11和ABCC2 mRNA表達水平比較 各組小鼠肝膽管側膜細胞ABCB11和ABCC2 mRNA表達水平比較差異均有統計學意義(均P<0.01)；LSD-t檢驗顯示：與N組相比，M組兩個基因mRNA表達水平差異有統計學意義(P<0.01)；與M組相比，U組、D組兩個基因mRNA表達水平差異均有統計學意義(均P<0.01)；與N組相比，U組ABCB11 mRNA表達水平差異有統計學意義(P<0.01)，見表3。

2.3各組小鼠肝膽管側膜細胞ABCB11和ABCC2蛋白表達IOD值比較 各組小鼠肝膽管側膜細胞組織ABCB11和ABCC2蛋白表達水平差異均有統計學意義(均P<0.01)；與N組相比，M組兩個蛋白表達水平差異有統計學意義(P<0.01)；與M組相比，U組、D組兩個蛋白表達水平差異均有統計學意義(均P<0.05)；與U組相比，D組ABCC2蛋白表達水平差異有統計學意義(P<0.05)，見表4、圖2。

表4 各組小鼠肝膽管側膜細胞ABCB11和ABCC2蛋白表達IOD值比較

a：P<0.01，與N組比較；b：P<0.05，與M組比較；c：P<0.05，與U組比較

3 討 論

本研究結果顯示，D組小鼠的防治有效率較U組有所改善，且膽汁均清亮、呈淡黃色，說明該兩種藥物均可有效改善結石形成微環境，減少病理性膽汁分泌，進而減少結石形成，但二者療效差異不甚明顯。熒光定量PCR和免疫組織化學實驗結果顯示，與M組比較，其他各組ABCB11和ABCC2的mRNA和蛋白表達水平均明顯升高；與N組比較，D組小鼠ABCB11和ABCC2 mRNA和蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。這兩種檢測方法得出結果均表現出相同的變化趨勢，該結果從不同的實驗方法及角度再次驗證了課題組前期闡述的觀點。

所有生物的遺傳信息都是以基因的形式儲存在細胞內的 DNA 分子中，而蛋白是生物功能的執行者亦是基因的產物，從mRNA到蛋白質的合成過程包括翻譯的起始、肽鏈的延伸、肽鏈的終止和釋放3個過程，該過程是由核糖體、tRNA、氨基酸、酶、腺苷三磷酸等多種物質共同參與的復雜途徑[7-8]。從基因表達角度來說，mRNA的轉錄表達決定了蛋白表達水平。相關研究表明膽結石的形成與MRP2/ABCC2和BSEP/ABCB11密切相關，與腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-6、IL-1β表達密切相關[9-10]。MRP2/ABCC2 mRNA經TNF-α、IL-6調控表達水平降低，而蛋白表達水平經TNF-α、IL-6、IL-1β調控減少；BSEP/ABCB11 mRNA和蛋白表達水平經TNF-α、IL-1β調控均明顯降低。由此推斷大黃靈仙膠囊可以改變炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β表達水平，進而穩定ABCB11和ABCC2 mRNA的轉錄，使轉運蛋白的表達趨于生理水平，最終減少病理性膽汁的分泌，維持膽汁酸池的平衡及肝細胞正常的分泌膽汁功能。然而大黃靈仙膠囊干預結石形成機制是直接調控mRNA的表達還是參與影響從mRNA到轉運蛋白的表達過程，或是經過上游TNF-α、IL-6、IL-1β調控作用的結果，下一步本課題組將嘗試通過該條信號通路的上游進行深入探究，進一步明確復方中藥防治膽石病的作用靶點，以期達到防治結石的目的。

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