乙型肝炎分子生物學檢驗方法的應用及質量控制

馬 雯

（寧夏人民醫院臨床檢驗診斷中心，寧夏 銀川 750004）

作為臨床最為常見的傳染性疾病，乙型肝炎患者中每年都有數以百萬的死亡例數。慢性乙型肝炎是HBV感染后的一種嚴重結果。在全球范圍內，我國乙型肝炎病毒感染率位居前列。據不完全統計，我國現如今已有1.3億人群屬于乙型肝炎病毒攜帶者，慢性肝炎患者的數量已經超過2300萬。我國病毒性肝炎患者接受治療時產生的直接費用可達到500億元。因此，準確、高效檢測乙型肝炎病毒對預防和治療具有非常重要的意義。

1 常規乙型肝炎檢驗

通常情況下，丙氨酸氨基轉移酶、門冬氨酸氨基轉移酶是臨床檢測乙型肝炎病毒感染的常見指標，同時也是肝功能與血清免疫標志物。常見性的乙型肝炎血清標志物主要包括了HBcAg與抗-HBc、HbeAg與抗-Hbe、HBsAg和抗-Hbs。ELISA是臨床中應用比較多的檢測方法。該種檢測方法能夠將HBV的應答系統與表達物檢測到，并能夠確定病毒感染后的免疫情況，同時還可了解乙型肝炎病毒在患者體內的復制狀況。ELSA檢驗方法操作簡單、方便、快捷[1-3]。但敏感度并不是非常高。最近幾年，國內外開始報道乙型肝炎病毒基因突變，分析HBsAg突變基因表達產物，就能夠將不同的突變體存在的抗原差異顯示出來。因此，即便臨床檢驗的時候，使用的是相同的血清，可最終獲得的檢測結果就可能出現差異，由此也就表明臨床指標存在漏檢的現象。

2 HBV分子生物學檢測

HBV-DNA是生物分子學常用的檢測指標。根據該指標可確定乙型肝炎病毒是否存在、陰干病毒的活性和傳染性等情況。檢測該指標利用常規的聚合酶鏈反應和熒光定量PCR方法。

2.1 常規聚合酶鏈反應法：該種檢驗方法的原理類似于DNA復制過程。該過程主要由變性、退火、延伸等步驟構成。模板溫度達到93 ℃后，雙鏈就會在環境的作用下斷裂為單鏈，單鏈就會引導DNA與引物結合。模板溫度下降55 ℃時，模板上的DNA就會與引物相互配對結合。在TapDNA聚合酶的指引下，DNA模板-引物復合物就會在相應的原料下合成新的復制鏈。在此期間，不斷重復這種過程，就會獲得數量較多的半保留復制鏈。如此往復循環，每循環過程需花費2～3 min，在數小時內就可將基因擴至龐大規模。此種檢測方法的靈敏度可達到ng水平，檢測結果能夠直接反應出HBV病毒的復制情況，從而為臨床診斷提供根據[4-7]。但這種檢測方法不能對準確基因定量、擴增污染物的假陽性和操作復雜等問題，由此影響臨床使用效率。

2.2 熒光定量方法：熒光定量是在PCR擴增期間將熒光素標記的特異性引物，在擴增中不斷出現能量轉移，減弱熒光強度。經過多個循環后，PCR反應的熒光強度和模板的量就是檢測指標中HBV-DNA拷貝的數據，實現定量的效果。應用熒光定量方法，可檢測HBV-DNA期間，還能夠進行量化，以此就可更好的了解乙型肝炎患者體內HBV復制和傳染性，并反映出復制水平、病變程度和治療進展。具有較高的特異性，靈敏度也非常高[8-10]。實際應用此種檢驗方法，無需處理PCR的產物。且通過閉關操作，可避免污染引起的假陽性。在此期間，使用實時檢測技術，所獲取的Ct值和原始模板數量表現出線性關系，可準確定量。該種方法具有PCR高靈敏度的同時，還可使用熒光探針。利用光電傳導系統就可將PCR擴增期間的熒光信號探測到，以此獲得定量結果，還具有DNA雜交的高特異性和光譜的高精確性，能夠彌補PCR缺陷。熒光定量PCR在實際應用中顯示出獨特的診斷價值。治療前對病毒定量檢測，由此就可指導抗病毒藥物的使用，以免盲目用藥；治療后通過PCR能夠直接準確測定患者體內的病毒情況，有利于判斷臨床效率；懷孕前測定PCR，有助于選擇最佳的懷孕時機；乙型肝炎孕婦檢測PCR，可及時診斷病情。

3 HBV生物學檢測的質量控制

HBV生物學檢測的質量控制對臨床診斷具有重要意義。首先，特異性。檢測HBV-DNA，通過對核酸序列特異性的檢測，就能夠將堿基的特異性區別開[11-16]。在此過程中，需應用熒光定量檢測技術的熒光產生的溫度、離子濃度以及探針，經過不斷的優化處理后，就可有效減少非特異性擴增。在此過程中，要實現特特異性擴增，還應注意聚合酶的選擇、溫度以及離子濃度等各方面影響因素。因而，在此過程中還需建立優化的擴增系統，才有利于BBV分子生物學檢測。其次，靈敏度。實際操作中，靈敏度的影響因素主要包括樣品的競爭性抑制物和其他抑制因子。對于不同核算擴增，實驗操作人員和實驗室均會影響靈敏度。其中PCR就遇到此種情況。因此，需加強各類因素指標的規范性，如統一試劑、操作人員對曲線上陰/陽性截取的統一等。最后，重復性。隨機擴增，樣品量少，變化性因素越多。此時就應當控制模板的循環數目，建立假陽性耐受性指標。在實驗操作中，改善擴增和測定方法的同時，樣本制備同樣非常重要，由此就能夠避免定量測定的差異性。另外還有樣本對檢測結果的影響加強控制。同時，實驗室質控和實驗間質評同樣可達到質量控制效果。實驗室質控可以購自公司，也可以自行配制；實驗間質評可通過參加國家衛計委臨檢中心每年兩次的室間質評活動。

4 結 語

乙型肝炎病毒生物學檢驗中，熒光定量PCR是目前最為理想的檢驗方法，在確定檢驗優點與質量控制的基礎上，才能夠采取預防性措施，發揮技術優勢，預防假陽性和假陰性的結果出現。