新型環氧化物水解酶AuEH1的表達及酶學性質

李興倩， 胡 蝶， 黃博梅， 李雪婷， 康雁君， 鄔敏辰*

（1.江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 無錫醫學院，江蘇 無錫 214122）

對映純環氧化物是一類合成手性終產物的砌塊，在醫藥、農藥和香料等領域有重要的應用價值[1]。 如手性苯基-2，3-環氧酸乙酯和 （S）-芳基縮水甘油醚可分別用于紫杉醇和阿替洛爾的合成[2]；（S）-環氧苯乙烷 （styrene oxide，SO）可用于抗艾滋病藥物 （-）-hyperolactone C和左咪唑 （Levamisole，一種殺線蟲和抗癌藥物）的合成[3-4]。與化學法相比，生物法制備手性環氧化物具有對映選擇性高、反應條件溫和及對環境友好等特點[5]，它又可分為合成法和拆分法，前者采用氧化還原酶不對稱環氧化前手性烯烴，而后者利用環氧化物水解酶拆分外消旋環氧化物。兩者相比，生物拆分法不需要金屬離子和輔酶，工藝較簡單[6]。

環氧化物水解酶 （epoxide hydrolase，EH，EC 3.3.2.3）能特異性水解環氧化物生成相應的鄰二醇及保留某一對映體[7]。從微生物獲取EHs，不僅來源廣泛、易通過發酵法大量獲得，且具有底物譜廣、對映選擇性高等特點[8-10]。近年來利用微生物EHs水解拆分外消旋環氧化物以獲取環氧化物或鄰二醇單一對映體已成為研究熱點。Lee等[11]克隆和表達了粘紅酵母 （Rhodotorula glutinis）EH編碼基因，并利用在胞內表達RgEH的重組畢赤酵母細胞水解拆分 （R，S）-SO，所獲 （S）-SO 的產率和對映體過量 （enantiomeric excess，e.e.）值分別為 36%和＞98%。Woo等[12]將源自 Novosphingobium aromaticivorans的EH基因在大腸桿菌中表達并純化了表達產物NEH，利用 NEH優先水解 （R）-SO的特性，拆分（R，S）-SO制備 （S）-SO， 其產率和e.e.值分別為11.7%和＞99%。本文作者選取實驗室保藏的A.usamii E001作為Aueh1供體菌株，RT-PCR擴增Aueh1，將其在大腸桿菌BL21中表達。分析重組AuEH1（reAuEH1）的酶學性質并利用其水解拆分 （R，S）-SO制備手性化合物 （S）-SO。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒和培養基

宇佐美曲霉 （A.usamii）E001菌株由作者所在實驗室保藏；大腸桿菌 （E.coli）JM109、BL21（DE3）和表達質粒 pET-28a（+），購自 Novagen公司；克隆質粒pUCm-T，購自上海Sangon公司。A.usamii培養基：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖、5 g/L （NH4）2SO4和 1 g/L （R，S）-SO，pH 6.0；LB培養基：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L NaCl，pH 7.2。

1.2 主要試劑和儀器

總RNA抽提試劑盒和DNA膠回收試劑盒，購自上海Sangon公司；RNA PCR試劑盒、rTaq DNA聚合酶、DNA Marker、限制性內切酶、T4 DNA連接酶和蛋白質Marker均購自大連TaKaRa公司；（R，S）-SO和 （S）-SO， 購自上海薩恩化學技術公司。GC-2010氣相色譜儀，日本Shimadzu公司產品；CYCLOSIL-B手性氣相色譜柱 （30 m×0.25 mm×0.25 μm），美國 Agilent科技公司產品。

1.3 PCR引物的設計

A.usamii屬于黑曲霉 （Aspergillus niger）的一個變種，它們有高度一致的基因組序列，如β-甘露聚糖酶基因的同源性＞99%[13-14]。據此，參照NCBI公布的A.niger M200 EH編碼基因序列，設計一對擴增Aueh1的PCR引物。

Aueh1-F：5′-CATATGTCTGCTCCGTTCGGCAA G-3′，下劃線部分為NdeⅠ酶切位點；

Aueh1-R：5′-GCGGCCGCCTACTTCTGCCACA CCTGCTC-3′，下劃線部分為NotⅠ酶切位點。

1.4 AuEH1編碼基因Aueh1的克隆

挑取A.usamii單菌落接種于30 mL培養基中，30℃、220 r/min培養36 h，離心收集菌體，按照總RNA抽提試劑盒說明書提取A.usamii總RNA。以RNA為模板、Oligo dT-Adaptor Primer為引物，逆轉錄合成cDNA第一鏈；以該鏈為模板、Aueh1-F和M13 Primer M4為引物，進行第一輪PCR：94℃3 min，30 個循環 （94 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s），72℃10 min；以第一輪PCR產物為模板、Aueh1-F和Aueh1-R為引物，進行第二輪PCR：94℃ 3 min，30 個循環 （94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 75 s），72 ℃10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分析、割膠回收目的條帶，與pUCm-T連接，轉化E.coli JM109。經藍白斑篩選和酶切鑒定正確后，送上海Sangon公司測序。測序正確的重組質粒命名為pUCm-T-Aueh1。

1.5 Aueh1在大腸桿菌中的表達

選用 NdeⅠ和 NotⅠ雙酶切 pUCm-T-Aueh1，割膠回收Aueh1，與經同樣酶切的pET-28a（+）連接，獲重組表達質粒pET-28a-Aueh1，轉化E.coli BL21（DE3）?？敲顾豅B平板篩選陽性轉化子，送上海Sangon公司測序。測序正確的轉化子 （即基因工程菌）命名為E.coli/Aueh1，不含目的基因的pET-28a（+）轉化子命名為E.coli/pET（空白對照）。參照余濤等[15]的方法，在IPTG終濃度0.15 mmol/L、18℃誘導表達reAuEH1。100 mL誘導發酵液經8 000 r/min離心收集菌體，用10 mL磷酸鉀緩沖液（20 mmol/L，pH 6.8） 懸浮，超聲波破碎細胞，收集上清作為reAuEH1酶液。采用SDS-PAGE分析重組表達產物。

1.6 氣相色譜分析及計算

樣品分析采用氣相色譜儀GC-2010、手性氣相色譜柱CYCLOSIL-B和氫火焰離子化檢測器。進樣口和檢測器溫度均為250℃；初始柱溫100℃，以5℃/min升溫至210℃；載氣氮氣，流量3.0 mL/min，分流比1∶50。 在此檢測條件下，正己醇、（R）-SO 和（S）-SO 的 保 留 時 間 分 別 為 3.837、6.433 min 和6.553 min。

其中：Y代表 （S）-SO的摩爾產率，S和R分別代表（S）-SO 和 （R）-SO 的最終摩爾濃度，C 代表 （R，S）-SO的初始摩爾濃度。

1.7 EH活性的測定

在 1.5 mL EP 管中加入 100 μL （R，S）-SO 溶液 （200 mmol/L）和 800 μL磷酸鉀緩沖液 （50 mmol/L，pH 6.8），35 ℃預熱 5 min； 加入 100 μL 適當稀釋的reAuEH1酶液，準確反應10 min。取400 μL反應液加入800 μL乙酸乙酯 （含5 mmol/L正己醇作內標），激烈振蕩，8 000 r/min離心5 min，吸取上層有機相，無水MgSO4干燥，過0.22 μm有機膜，按1.6方法進行氣相色譜分析。在上述測定條件下，每分鐘水解 1 μmol（R，S）-SO 所需的酶量定義為1個EH活性單位 （U）。

1.8 reAuEH1酶學性質的分析

1.8.1 溫度對酶活性的影響 在20～50℃下按1.7方法測定酶活性。最適溫度定義為最高酶活性（100%相對酶活性）所對應的溫度。將酶液置于20～45℃下保溫1.0 h，按1.7方法測定殘余酶活性。以未保溫酶液 （100%相對酶活性）為對照，殘余酶活性在85%以上定義為熱穩定。

1.8.2 pH對酶活性的影響 在pH 6～9下按1.7方法測定酶活性。最適pH定義為最高酶活性所對應的pH值。將酶液在 pH 3～10、25℃處理1.0 h，按1.7方法測定殘余酶活性。殘余酶活性在85%以上定義為pH穩定。

1.8.3 金屬離子和EDTA對酶活性的影響 將酶液分別與不同金屬離子及EDTA溶液 （終濃度1.0 mmol/L）混合，25℃處理1.0 h，按1.7方法測定殘余酶活性。對照以緩沖液取代金屬離子或EDTA。

1.9 reAuEH1水解拆分 （R，S）-SO 在 10 mL EP管中分別加入 0.6 mL （R，S）-SO （200 mmol/L）、4.8 mL磷酸鉀緩沖液 （50 mmol/L，pH 6.5）和 4.8 U reAuEH1（終體積6 mL），35℃進行水解拆分反應，分別在 20、40、50、60 min 和 80 min 取樣。 反應液按1.7方法進行處理，并按1.6方法進行色譜分析及計算 （S）-SO摩爾產率和e.e.值。

2 結果與分析

2.1 AuEH1編碼基因Aueh1的克隆及分析

以A.usamii總RNA逆轉錄合成的第一鏈cDNA為模板，第一輪PCR獲得約1 400 bp的產物（圖1泳道1）；再以純化的第一輪PCR產物為模板，第二輪PCR獲得約1 200 bp的目的基因Aueh1（圖1泳道2）。將Aueh1與pUCm-T連接，獲重組質粒pUCm-T-Aueh1。測序結果顯示，Aueh1全長1 197 bp，編碼398個氨基酸，所獲Aueh1序列遞交至GenBank數據庫，登錄號為KP249712。BLAST server同源序列搜尋 （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和DNAMAN 6.0同源序列比對結果顯示，Aueh1與A.niger （DQ458230）、A.niger （AJ238460）、A.oryzae RIB40 （XM_001818259）、A.flavus NRRL3357（XM_002373494） 和 A.clavatus NRRL （XM_00127 0913）EHs編碼基因的序列同源性分別為 87.6、87.4、64.8、64.7和63.6%，表明本研究克隆的Aueh1是一種新型的EH編碼基因。

圖1 PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1 Analysis of the PCR products by agarose gel electrophoresis

2.2 Aueh1在E.coli BL21（DE3）中的表達

將E.coli/Aueh1和E.coli/pET按1.5方法進行誘導表達。SDS-PAGE分析結果顯示，E.coli/Aueh1全細胞及其破碎上清液約在44.3×103處有特異性目的條帶 （圖2泳道2—3），E.coli/pET在該處無特異性條帶 （圖2泳道1）。另外，E.coli/Aueh1細胞破碎沉淀在該處也無條帶 （圖 2泳道 4），表明reAuEH1在E.coli BL21胞內實現了可溶性表達。按1.7方法測得reAuEH1酶液的活性為8.12 U/mL。

圖2 重組大腸桿菌表達產物的SDS-PAGE分析Fig.2 Analysis of the products expressed in recombinant E.coli by SDS-PAGE

2.3 reAuEH1酶學性質的分析

2.3.1 最適溫度及溫度穩定性 按1.8.1方法分析了溫度對reAuEH1活性的影響 （圖3）。該酶的最適溫度為40℃，在30～45℃范圍內催化活性較高，20℃和50℃的相對酶活性分別為64%和55%。同時，reAuEH1在20～40℃保溫1.0 h，殘余酶活性均在85%以上，當溫度超過40℃，酶活性快速下降，表明reAuEH1屬于中溫酶。

圖3 reAuEH1的最適溫度及溫度穩定性Fig.3 Temperature optimum and stability of reAuEH1

2.3.2 最適pH及pH穩定性 按1.8.2方法分析了pH對reAuEH1活性的影響 （圖4）。該酶的最適pH為6.5，pH 9.0的相對酶活性僅為19%，表明該酶屬于中性酶。同時，reAuEH1在pH 5～9處理1.0 h，殘余酶活性均在85%以上。

圖4reAuEH1的最適pH及pH穩定性Fig.4 pH optimum and stability of reAuEH1

2.3.3 金屬離子及EDTA的影響 按1.8.3方法測定了金屬離子及EDTA對reAuEH1活性的影響（圖5）。Ag+和Cu2+對該酶活性的抑制作用較大，殘余酶活性分別僅為54%和44%，其它金屬離子及EDTA對酶活性的影響不大。

圖5 金屬離子及EDTA對reAuEH1活性的影響Fig.5 Effects of various metal ions and EDTA on the activity of reAuEH1

2.4 reAuEH1 水解拆分 （R，S）-SO

按1.9方法提供的反應條件，利用reAuEH1對（R，S）-SO 進行對映選擇性拆分制備 （S）-SO，并按1.6方法分析及計算 （S）-SO的產率和e.e.值隨反應時間的變化值 （圖6）。reAuEH1優先水解 （R）-SO，在20 min內 （R）-SO的摩爾濃度迅速下降，（S）-SO 的 e.e.值快速上升；當反應至 50 min，（S）-SO的產率為30.8%、e.e.值＞99%；延長反應時間，（S）-SO摩爾濃度緩慢降低，導致 （S）-SO的產率下降。Lee等[11]利用在胞內表達粘紅酵母EH（RgEH）的重組畢赤酵母細胞拆分 （R，S）-SO，所獲 （S）-SO的產率為 36%、e.e.值＞98%。Woo等[16]利用 Gordonia sp.H37 全細胞水解 （R，S）-SO，所獲 （S）-SO 的產率為 23.9%、e.e.值＞99.9%。

圖6 反應時間對reAuEH1水解拆分 （R，S）-SO的影響Fig.6 Effect of reaction time on the hydrolytic resolution of（R，S）-SO by reAuEH1

3 結語

本研究運用RT-PCR技術從A.usamii E001中克隆了一種新型EH的編碼基因Aueh1，并將該基因在E.coli BL21（DE3）中進行了表達。酶學性質分析表明，reAuEH1具有較高的催化活性、溫和的反應條件、良好的溫度和pH穩定性以及較高的對映選擇性，且大多數金屬離子及EDTA對該酶活性影響不大，所有這些特性使reAuEH1在水解拆分外消旋環氧化物制備高純度手性環氧化物或鄰二醇等方面有潛在的應用價值。本文作者利用reAuEH1拆分 （R，S）-SO 制備了 （S）-SO，其摩爾產率和 e.e.值分別為30.8%和＞99%，但其底物譜和對映選擇性機理等還有待于進一步研究。

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