姜黃素環糊精分子包合物的構建和優化

李 藝， 梅 虎， 趙春景， 王 紅， 羅 文， 張景勍*

（1.重慶醫科大學 藥物高校工程研究中心，重慶 400016；2.重慶大學 生物工程學院，重慶 400023；3.重慶醫科大學附屬第二醫院藥劑科，重慶 400010）

姜黃素（curcumin，CCN）最早是從植物根莖提煉出來的一種印度香料，作為抗炎草藥，具有悠久的使用歷史。CCN溶于乙醇、丙酮和氯仿等有機溶劑，幾乎不溶于水及乙醚。藥理作用廣泛，安全有效性高，價格低廉，使其具有廣闊的應用前景。但由于CCN的溶解度極低，使其口服吸收不完全，代謝消除迅速，生物利用度低，限制了其應用。藥物被環糊精大分子包合后可明顯改善藥物的理化性質，提高藥物的水溶性和穩定性，提高藥物的生物利用度以及改變藥物在體內的分布情況等。為了改善CCN在體內的吸收，提高其口服生物利用度，本實驗選用水溶性大、生物相容性好的的羥丙基-β-環糊精（hydroxypropyl beta cyclodextrin，HBCD） 為材料，構建了姜黃素羥丙基-β-環糊精分子包合物（curcumin-cyclodextrin inclusion complexes，CCIC），通過顯微觀察法、紅外光譜法、差示量熱掃描法驗證了包合物的形成，并優化了CCN的制備工藝，成功提高了CCN在水溶液中的溶解度，以計算機模擬了CCIC的分子結構及CCN分子包合前后的能量變化。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 主要材料、試劑 羥丙基-β-環糊精：江蘇泰興新鑫醫藥輔料有限公司產品；姜黃素：陜西森弗生物制藥有限責任公司產品；去離子水，其它試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器 Monobloc AB204-E型電子天平：瑞士METTLER-TOLEDO儀器公司產品；UV-3150型紫外分光光度儀：日本島津公司產品；DZF-6020型真空干燥箱：上海博運實業有限公司醫療設備廠制造；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市于華儀器有限責任公司產品；UV-7504型紫外可見分光光度儀：上海精密科學儀器有限公司產品；光學顯微鏡：鳳凰光學集團有限公司產品；STA 449C型綜合熱分析儀：德國耐馳儀器制造有限公司產品；WQF-510傅里葉變換紅外光譜儀：上海第二光學儀器廠制造；THZ-82水浴恒溫振蕩器：金壇市榮華儀器制造有限公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 含量測定方法的確定 精密稱取CCN 11.1 mg加入適量乙醇溶液溶解，將其移入100 mL的棕色容量瓶中，并用乙醇稀釋至刻度，搖勻制成儲備液備用。取儲備液稀釋適當倍數，以乙醇溶液為空白對照，在200～800 nm進行紫外掃描得CCN紫外吸收光譜，確定最大吸收波長。取HBCD適量溶于乙醇中，以乙醇溶液為空白對照，在200～800 nm進行紫外掃描，確定輔料有無干擾。精密量取上述母液10 mL于100 mL的容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度線， 稀釋搖勻。 取該溶液 1、2、3、4、5 mL于10 mL的容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度線，稀釋搖勻。以乙醇溶液為空白對照，在425 nm處測吸光度，以CCN質量濃度（C）對吸光度（A）進行線性回歸，繪制標準曲線。按線性范圍分別配制高、中、低3種濃度的CCN乙醇溶液，在425 nm測定吸光度，計算實際濃度。同日內測定日內精密度，連續3 d測定日間精密度。稱取已知含量的CCIC適量溶于乙醇溶液中，移入10 mL的容量瓶加乙醇溶液至刻度。取1 mL上述溶液分別于9個10 mL的容量瓶中。取CCN儲備液1.1、1.4、1.7 mL于上述容量瓶中，每濃度設置3組平行，用乙醇定容至刻度線搖勻。取出適量用乙醇稀釋后，于425 nm處測定吸光度值，代入回歸方程求出藥物濃度，并計算回收率。

1.2.2 CCIC中CCN含量的測定 精密稱取CCIC適量溶于乙醇溶液中，移至10 mL的容量瓶中，用乙醇稀釋至刻度搖勻。取上述溶液再用乙醇溶液稀釋適當倍數，于425 nm處測定吸光度，代入標準方程，計算CCIC中CCN的含量。

1.2.3 CCIC包合物的制備 采用研磨法制備CCIC，稱取適量HBCD加入少量蒸餾水，研磨均勻，再緩慢加入CCN，邊加邊研磨至規定時間，適當干燥，沉淀用乙酸乙酯洗滌3次，再于30℃真空干燥3 h，研細即得 CCIC[1]。

1.2.4 CCIC最佳制備工藝的選擇 選擇B投料比（CCN與HPCD的摩爾比）、C包合溫度、D研磨時間這3種對包合物制備影響較大的因素作為考察對象，每因素各取3水平，采用L9（34）正交實驗表設計實驗方案，見表1。

表1 CCIC制備工藝因素-水平表Table 1 Prepare of CCIC levels of factors

按正交實驗設計表進行試驗，以CCN溶解度為考察指標，確定最佳制備工藝[2]。

1.2.5 相溶解度法測定CCN與HBCD的包合常數精密稱取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol HBCD 溶于5 mL蒸餾水中，向上述溶液中加入過量CCN，放入恒溫振蕩器中（25±2）℃，振蕩24 h使溶解達到平衡狀態。取出溶液1 mL，微孔濾膜過濾，濾液用乙醇稀釋至適當倍數，在425 nm處測定紫外吸光度。以CCN含量對HBCD含量作圖，即得相溶解度圖[3-5]。

1.2.6 溶解度測定 稱取適量CCN溶于25 mL蒸餾水中制備成過飽和溶液，于磁力攪拌器上攪拌，不同時間取樣1 mL，用0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液用乙醇稀釋適當倍數，在425nm處測定吸光度值。溶解平衡時間為相鄰樣品測定的A值小于0.004時所對應的時間。按最優化處方工藝制備CCIC，稱取適量溶于25 mL蒸餾水中制備成CCN過飽和溶液，同方法1.2.2取樣并處理，測定吸光度值，計算得CCIC中CCN在蒸餾水中溶解度[6]。

1.2.7 包合物的鑒定 包合物的鑒定有顯微觀察法，差示量熱掃描分析和紅外分光光度法。顯微觀察法是分別取CCN、HBCD、CCN與HBCD物理混合物、CCIC在光學顯微鏡下觀察。差示量熱掃描分析是分別取CCN、HBCD、CCN與HBCD物理混合物、CCIC進行差示掃描量熱分析，以Al2O3為參比，升溫速度為10℃/min，氮氣流速為20 mL/min，掃描范圍為-20～350℃，取樣量為5 mg。分別記錄升溫曲線。紅外分光光度法是將CCN、HBCD、CCN與HBCD物理混合物、CCIC加入適量KBr壓片，在4000～400 cm-1范圍內累加掃描8次，分辨率為2 cm-1。

1.2.8 計算機擬合分子包合 采用基于CHARMm的能量產生模型模擬CCN和HBCD的化學結構計算包合前后的能量變化及可能的構象[7]。

2 結果與討論

2.1 含量測定方法建立 CCN儲備液以乙醇稀釋后的紫外吸收光譜見圖1，由圖1可知CCN在425 nm處有最大吸收峰。HBCD的乙醇液在425 nm處沒有吸收，不干擾CCN測定，所以選擇425 nm為測定波長。以CCN質量濃度（C）對吸光度（A）進行線性回歸，得線性回歸方程A=0.149 3C+0.005 8，R=0.999 9。 CCN在1.1～5.5 μg/mL濃度范圍內與吸光度呈現良好的線性關系，見圖2。日內精密度結果見表2，日間精密度結果見表3。從表2和表3中可以看出，溶液高、中、低濃度日內RSD為0.91%、0.35%、0.58%；日間RSD為1.23%、0.47%、0.75%，精密度符合要求。平均回收率分別為99.42%、100.14%、100.12%，RSD 為 0.45%、0.92%、1.17%，見表4。

圖1 CCN的乙醇溶液紫外掃描圖Fig.1 Ultraviolet scanning spectrum of CCN ethanolsolution

圖2 CCN的無水乙醇溶液標準曲線Fig.2 Standard curve of the CCN in ethanol

表2 日內精密度測定結果Table 2 Result of the intra-day precision

表3 日間精密度測定結果Table 3 Result of the inter-day precision

表4 回收率試驗Table 4 Recovery experiment

2.2 CCIC最佳制備工藝的選擇

按正交實驗設計表進行試驗，以CCN溶解度為考察指標，確定最佳制備工藝。正交實驗結果見表5，方差分析結果見表6。

表5 正交試驗結果Talle 5 Result of the results of orthogonal experiment

表6 方差分析結果Table 6 Results of analysis of variance

由表5正交實驗結果可知因素B包合投料比的極差R最大，所以其對包合實驗的影響最大，其次依次為因素D研磨時間和因素C包合時間。由表6方差分析結果可知3種因素對實驗均有顯著影響（P＜0.05）。實驗結果較大者為最優處方，根據結果確定最優處方工藝為B1C2D3。即包合投料摩爾比為1∶1，研磨溫度為40℃，包合時間為1.5 h。按照最優化處方工藝B1C2D3重復制備3批CCIC，用“1.2.6溶解度測定”中方法測定每批CCIC溶解度，得到最優化處方工藝下CCN的溶解度為（1.72±0.03）mg/mL。

藥物與環糊精一般形成1∶1或1∶2的包合物。由相溶解度法測定CCN與HBCD的包合常數，得到CCN與HBCD形成包合物的理論摩爾比為1∶1。而通過正交試驗也驗證了當CCN與HBCD的投料摩爾比為1∶1時，形成的CCIC有最大溶解度。

由正交試驗得出制備CCIC的最優工藝為：包合投料摩爾比為1∶1，研磨溫度為40℃，包合時間為1.5 h。隨包合時間增加，包合效果也增加。而隨溫度的增加，包合效果卻是先升高后降低，可能是由于CCIC在較高溫度下不穩定。

2.3 相溶解度法測定CCN與HBCD的包合常數

相溶解度圖見圖3。

圖3 CCN相溶解度曲線Fig.3 Phase solubility diagram of the CCN

由圖3可知CCN溶解度隨HBCD的增加而增加。CCN溶解度對HBCD濃度作圖為直線，二者具有線性關系。直線方程為y=0.001x+0.000 4，R2=0.999 4＞0.990 0為AL型。形成包和物的化學計量比為1∶1。由包合平衡常數K=斜率/截距（1-斜率）[8]得出 K=2.50×103L/moL。

K1∶1的數值范圍在 0～1.00×105L/moL，包合平衡常數K越大，藥物與環糊精形成的包合物越穩定。當包合平衡常數K小于80 L/moL時，則藥物不適宜制備成包合物。相平衡溶解度法測得CCN與HBCD包合平衡常數K=2.50×103L/moL，包合平衡常數較大，形成的包合物較穩定。

2.4 溶解度測定

實驗表明CCN達到溶解平衡的時間為30 min。按最優化處方工藝制備CCIC中CCN在蒸餾水中溶解度為（1.76±0.02） mg/mL（n=3）。

2.5 包合物的鑒定

顯微觀察法顯示：在光學顯微鏡下觀察，CCIC為不規則形狀，明顯不同于CCN和HBCD的簡單物理混合物，證明形成了CCIC。差示量熱掃描圖譜見圖4。CCN在175℃有一個吸熱峰，為藥物的熔融峰。CCN與HBCD物理混合物在該溫度時有此吸熱峰，而在CCIC中該吸熱峰前移，峰型也明顯減小，表明CCN與HBCD形成了包合物。紅外分光光度法圖譜見圖5。通過比較藥物包合前后在紅外區吸收的特征差異，根據吸收峰的變化情況（吸收峰的降低、位移或消失），以此證明藥物與環糊精是否產生包合作用。在包合物圖譜中藥物特征吸收峰1 207 cm-1峰消失，1 510、1 457、1 282、1 153cm-1峰強度明顯減弱，表明CCIC形成。

圖4 差示掃描量熱圖Fig.4 Differential scanning colorimetry analysis

2.6 計算機擬合分子包合物

計算機模擬研究結果說明包合后體系能量下降了約175.728 kJ/mol，提示HBCD可能包合CCN后形成了CCIC，其可能的構象見圖6。CCN和HBCD的化學結構包合前后的能量變化見表7。

圖5 紅外吸收光譜圖Fig.5 Infrared absorption spectrogram

圖6 CCIC計算機擬合得到的構象圖Fig.6 Computer fitting conformation

表7 分子擬合CCIC包合前后的能量變化Table 7 Energy changes of inclusive CCIC according to the molecular modeling

3 結 語

本實驗通過預試驗對飽和水溶液法、研磨法、超聲法制備CCIC進行比較，得出研磨法制備的CCIC較其它兩種方法制備的CCIC溶解度高，所以選用研磨法制備。HBCD水溶性較β-環糊精大[9]，通過預試驗對HBCD和β-環糊精進行了考察，研磨法制備HBCD和β-環糊精包合物，HBCD包合物溶解度明顯高于β-環糊精包合物。所以試驗選擇以HBCD為材料研磨法制備CCIC。

CCN在蒸餾水中的溶解度為4.5×10-5mg/mL，制備成包合物后CCN溶解度增大了3.82×104倍。由此可見將CCN制備成CCIC，可大大提高CCN在水溶液中的溶解度。

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