Bacillus altitudinis SYBC hb4堿性β-葡萄糖苷酶基因的克隆表達及酶學性質的研究

劉 群 ， 管政兵 ， 蔡宇杰 ， 廖祥儒 *

（1.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

纖維素是自然界含量最多、分布最廣的一種多糖，也是天然的可再生能源物質，在醫藥、食品、工業、農業中有著重要的作用。纖維素酶是降解纖維素形成葡萄糖的一組復合酶的總稱，主要包括由外切β-葡聚糖酶、內切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等組成。其中，β-葡萄糖苷酶 （β-glucosidase，EC3.2.1.21）又稱β-D-葡萄糖苷水解酶，是一種能催化水解β-葡萄糖苷鍵生成葡萄糖的酶，是纖維素酶系中一類重要的酶[1]。纖維素酶在外切β-葡聚糖酶、內切β-葡聚糖酶作用下水解成纖維二糖，纖維二糖在β-葡萄糖苷酶的作用下水解為葡萄糖[2]。β-葡萄糖苷酶的研究可以追溯到1837年，Liebig等[3]首次在苦杏仁汁中發現了該酶。纖維素酶的最適pH值一般在4.5～6.5，少數在偏堿性pH范圍內發揮作用的纖維素酶稱為堿性纖維素酶。隨著現代工業的不斷發展，對堿性纖維素酶的需求量越來越大，它主要應用于洗滌行業[4-6]、造紙行業、紡織行業以及醫藥食品當中。

上世紀70年代初日本生物學家從芽孢桿菌中首先發現堿性纖維素酶[7]，隨著分子生物學技術的發展，越來越多的堿性纖維素酶基因被發現，包括堿性β-葡萄糖苷酶。由于植物來源的β-葡萄糖苷酶酶活比微生物來源的低的多，所以目前研究的對象主要集中于微生物中[8]。微生物來源的堿性β-葡萄糖苷酶可以應用于紡織行業，因為β-葡萄糖苷酶在堿性條件下時更有利于形成聚合物[9]。近年來的研究還發現堿性β-葡萄糖苷酶在微生物循環、生產工業燃料、減少工業生產中的環境污染等方面有重大應用。Meng等[10-11]發現海洋微生物中能產生耐堿性強的β-葡萄糖苷酶及β-葡聚糖酶。但目前海洋微生物在工業中的應用還有一定難度。Kaur等人[12]報道了青霉菌能產生高濃度的β-葡萄糖苷酶，并且在堿性條件下表現出明顯的活性和較好的熱穩定性但并未提及具體酶活大小。Mao等人[13]采用大腸桿菌E.coli BL21（DE3）進行β-葡萄糖苷酶的異源表達，所得重組酶的最適pH值為8.0，但當pH值上升到9.0時剩余酶活在不到40%，且在堿性條件下穩定性較差。

1989年，Gonzalez首次將β-葡萄糖苷酶基因克隆出來并成功表達，但限于當時技術，表達活力并不高，粗酶液的酶活力只有0.364 U/mL[14]。朱寶龍[15]構建的畢赤酵母工程菌所表達的重組β-葡萄糖苷酶酶活可達38 U/mL。然而，目前國內對堿性β-葡萄糖苷酶的研究僅僅停留在探索階段，對酶活大小以及發酵產酶水平報道較少。因此通過基因克隆技術，構建堿性β-葡萄糖苷酶的基因工程菌是當前實現堿性β-葡萄糖苷酶量產的關鍵步驟。

針對以上問題，作者從蜂蜜中篩選出一株來源安全并在堿性環境中生長良好的高地芽孢桿菌Bacillus altitudinis SYBC hb4，通過對該芽孢桿菌中的β-葡萄糖苷酶基因bglA克隆表達，獲得了耐堿性好、熱穩定較好的重組β-葡萄糖苷酶。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 所用菌株是從實驗室已有的蜂蜜中篩選，經生理生化實驗及16S rRNA基因序列分析鑒定為芽孢桿菌屬 （Bacillus），命名為 Bacillus altitudinis SYBC hb4[16]。

1.1.2 主要試劑 細菌基因組DNA提取試劑盒、質粒小量抽提試劑盒和DNA膠回收試劑盒：購自上海生工公司；對硝基苯基β-D-葡萄糖苷：購于Sigma（St.Louis，MO）公司；大腸桿菌 JM109 感受態細胞、16S rRNA基因測序引物、應用細菌基因組DNA抽提試劑盒、氨芐青霉素 （Amp）、Taq酶、pColdII載體：購自TaKaRa公司；其他常規試劑均為分析純，購自國藥集團。

1.1.3 培養基 LB液體培養基 （g/L）：胰蛋白胨10，NaCl 10， 酵母粉 5；pH 7.0～7.2，115 ℃滅菌 20 min。固體培養基再額外添加2 g/dL的瓊脂。

LB-Amp培養基 （g/L）：LB固體培養基滅菌至40～50℃后加入Amp，終質量濃度為0.1 mg/L。

1.2 實驗方法

1.2.1 芽孢桿菌Bacillus altitudinis SYBC hb4總DNA的提取 應用細菌基因組DNA抽提試劑盒按照其操作提取Bacillus altitudinis SYBC hb4菌體基因組總DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定其質量和純度，紫外分光光度計測定其濃度。

1.2.2 β-葡萄糖苷酶基因的PCR擴增 根據芽孢桿菌Bacillus altitudinis SYBC hb4全基因組測序的序列設計上下游引物g1和g2（如表1所示）。兩條引物的5’端分別含有單一的BamI和PstI（表1中下劃線所示）限制性酶切位點。以上述芽孢桿菌Bacillus altitudinis SYBC hb4基因組為模板，以上述g1和g2為特異性引物，擴增出芽孢桿菌Bacillus altitudinis SYBC hb4中β-葡萄糖苷酶基因（bglA）全長編碼框序列（1 419 bp）。PCR反應條件為：以基因組DNA為模板，在50 μL反應體系中，加入5 μL 10 ×ExTaqBuffer、2 μL 25 mmol/LMgCl2、4 μL 2.5 mmol/LdNTP混合物、以及20 μmol/L上下游引物各1μL、Ex Taq 酶 （Takara 公司）1 μL 及 DNA 模板 1 μL、補水至50 μL。PCR循環參數為：94℃預變性5 min，再進行30個循環 （98℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min），最后于72℃延伸10 min。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離后，用割膠回收試劑盒回收1 419 bp的DNA條帶，置4℃冰箱中保存。

表1 PCR擴增引物Table 1 Sequences of the PCR primers

1.2.3 β-葡萄糖苷酶的基因克隆與序列分析 目的片段經過割膠回收后，分別用BamHI和PstI對膠回收產物以及pColdII質粒進行雙酶切。雙酶切產物經純化后，將pColdII質粒與目的基因片段16℃連接過夜。將20 μL的連接產物轉化至E.coli DH5α感受態細胞中，在含有Amp的平板上篩選，進行菌落PCR驗證。經BamHI和PstI雙酶切驗證陽性質粒，并由上海尼桑生物科技有限公司完成測序。將測序正確的重組質粒轉化至E.coli BL21（DE3）感受態細胞中。

以bglA基因為模板，用NCBI數據庫中Blast在線工具進行序列同源性分析。

1.2.4 重組大腸桿菌的誘導表達 按體積分數1%的接種量將培養過夜重組大腸桿菌接種于50 mL含有Amp的LB培養基中，置于37℃、轉速220 r/min培養至OD600值約為0.4，15℃靜置30 min，添加IPTG到終濃度0.5 mmol/L培養約24 h。培養完成后收集細胞，超聲破碎，破碎液4℃、8 000 r/min離心20 min，收集上清液即粗酶液，測定酶活驗證有無活性，進一步SDS-PAGE驗證相對分子質量大小。

1.2.5 酶活測定方法 取0.5 mL粗酶液，加入0.5 mL 30 mmol/L對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷。將此反應混合液在60℃水浴鍋反應1 h。反應結束后，立即加入2.5 mL 1 mol/L的Na2CO3終止液終止反應，冷卻至室溫后在400 nm波長處測定吸光值。另外，取相同條件下粗酶液在沸水中煮沸5 min后再加入底物中，混合反應液在60℃水浴鍋反應1 h，作為空白對照組。

酶活力單位定義：1 mL酶液每分鐘釋放出1 μmol對硝基苯酚的酶量定義為一個酶活力單位[17]。

1.2.6 重組β-葡萄糖苷酶的分離純化 將重組菌體經破碎離心后，收集的上清液過孔徑0.22 μm的濾膜，選擇使用1 mL HisTrap HP組氨酸標簽親和層析柱 （鎳柱）進行分離純化。純化開始時先用Blinding buffer（2 mmol/L磷酸鈉緩沖液，0.5 mol/L NaCl，500 mmol/L咪唑）梯度洗脫結合上的蛋白質，收集穿透液以及洗脫峰的蛋白質。測定有無酶活，進一步SDS-PAGE蛋白質條帶是否單一，分析分離純化情況。

1.2.7 重組β-葡萄糖苷酶酶學性質的研究 以對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷為底物，與不同pH的緩沖液在60℃下水浴反應1 h，測定酶活，確定重組β-葡萄糖苷酶的最適反應pH。然后在最適pH下值在， 在 30、40、50、60、70、80、90 ℃下水浴反應 1 h，測定酶活，確定重組β-葡萄糖苷酶的最適反應溫度。以反應液的最高酶活為100%計算相對酶活。

以對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷為底物研究重組β-葡萄糖苷酶的熱穩定性和pH穩定性。用pH值為7.0的酶液在60℃水浴保溫不同時間后測定酶活，并以該條件下未經保溫處理的酶液酶活為100%，計算相對酶活。作出酶活在60℃時隨時間的變化曲線。將相同量的酶液分別在不同pH值（pH 3.0～8.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH 8.0～9.0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液，pH 9.0～10.0碳酸鈉-碳酸氫鈉）下30℃水浴保溫1 h后于60℃測定剩余酶活。以各自的初始酶活作為100%，計算相對酶活。

1.2.8 金屬離子對重組β-葡萄糖苷酶酶活的影響將相同量的酶液加入到終濃度為0.5 mmol/L和5 mmol/L的不同金屬離子溶液中，以對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷為底物測定酶活，以未經任何處理的酶液的酶活為100%，計算相對酶活。比較不同濃度不同金屬離子對重組β-葡萄糖苷酶酶活的影響

2 結果與討論

2.1 β-葡萄糖苷酶基因的克隆、鑒定及表達載體的構建

2.1.1 基因bglA序列聚類分析 利用NCBI數據庫，以bglA基因的核苷酸序列為模板利用Blast在線工具序列對比進行同源性分析，結果顯示，其核苷酸序列與NCBI數據庫中已知的β-葡萄糖苷酶Bacillus pumilus W3同源性達98%。

2.1.2 β-葡萄糖苷酶基因的PCR擴增 根據bglA的基因序列，設計了上下游引物。通過PCR擴增的方法以芽孢桿菌Bacillus altitudinis SYBC hb4的全基因組DNA為模板進行擴增。PCR產物經核酸電泳驗證得到大小1 419 bp的目的片段（圖1）。將片段測序后，測序結果表明擴增得到了β-葡萄糖苷酶基因片段。

圖1 Bacillus sp.SYBC hb4的bglA基因的PCR擴增Fig.1 Amplification of bglA of Bacillus sp.SYBC hb4 by PCR

2.1.3 重組質粒的構建 用BamHI和PstI將PCR回收的目的片段進行雙酶切然后與經過相同限制性內切酶雙酶切過的質粒pColdII 16℃連接過夜。將連接產物轉化到感受態細胞E.coli DH5α中，挑選陽性克隆的轉化子并提取質粒就行雙酶切驗證（圖2）。所得重組質粒pColdII-bglA（圖3）經測序結果與目的基因的堿基序列一致，重組質粒構建成功。

圖2 重組質粒pColdⅡ-bglA的酶切驗證Fig.2 Identification of recombinant plasmid pColdⅡ-bglA

圖3 重組質粒pColdⅡ-bglA圖譜Fig.3 Map of recombinant plasmid pColdⅡ-bglA

2.2 重組質粒在大腸桿菌中的誘導表達及分離純化

2.2.1 重組質粒的誘導表達 將測序正確的重組質粒 pColdII-bglA轉化至 E.coli BL21（DE3）感受態細胞中，將呈陽性克隆的重組菌保存后按照1.2.4中的方法加IPTG低溫誘導表達，培養24 h后收集菌體進行超聲破碎，破碎后低溫離心收集上清液即粗酶液測定酶活和SDS-PAGE驗證蛋白質相對分子質量大小。通過軟件計算bglA的蛋白質大小為53.92×103，以不加IPTG誘導為對照，如圖4可以看出SDS-PAGE電泳結果表明，在相對分子量53×103附近出現了明顯的蛋白質表達條帶。

2.2.2 重組蛋白bglA的分離純化 粗酶液使用1 mL HisTrap HP組氨酸標簽親和層析柱（鎳柱）進行分離純化，純化結果如圖5所示。本實驗中所選用的質粒pColdII帶有組氨酸標簽，經鎳柱純化的蛋白質，具有組氨酸標簽的蛋白質可以跟鎳結合，不帶有組氨酸標簽的雜蛋白質被去除，得到的蛋白質相對較純。經鎳柱純化后重組β-葡萄糖苷酶經SDS-PAGE驗證后，通過圖5可以看出，與粗酶液相比，純化后的蛋白質在53×103處有一條明顯的單一條帶，但是也有幾條雜帶，說明純化后蛋白質還需進一步純化。各步純化結果如表2所示，最后所得蛋白質的純化倍數為2.70，回收率達到85.32%。

圖4 重組表達bglA蛋白的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE anslysis of the recombinant bglA

圖5 純化后重組β-葡萄糖苷酶的SDS-PAGE結果Fig.5 SDS-PAGE anslysis of the purified recombinant β-glucosidase

表2 重組β-葡萄糖苷酶的分離純化水平Table 2 Level of recombinant β-glucosidase be purified

2.3 重組β-葡萄糖苷酶酶學性質的研究

2.3.1 重組β-葡萄糖苷酶的最適反應溫度及熱穩定性的研究 以對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷為底物，研究不同溫度對底物反應的影響，從而找到酶的最適反應溫度。如圖6（a）可以看出重組的β-葡萄糖苷酶的最適反應溫度為60℃，在該溫度下酶活最高。當溫度過低時，底物分子的運動速率較慢，其與酶的結合率低，所以在較低的溫度下酶活比較低；當溫度過高時，蛋白容易變性，酶比較容易失去活性，因此溫度過高，酶活也不高。

將重組β-葡萄糖苷酶在pH 7.0、溫度60℃時水浴保溫不同時間測定剩余酶活，考察重組β-葡萄糖苷酶的溫度穩定性。如圖6（b）所示，隨著時間的增加，酶活越來越低，重組β-葡萄糖苷酶的半衰期大約在150 min，在保溫300 min后仍然有10%的剩余酶活，說明該重組β-葡萄糖苷酶有較好的溫度穩定性。目前報道的大腸桿菌重組β-葡萄糖苷酶溫度穩定性一般都比較好，如Wolosowska所表達重組β-葡萄糖苷酶在80℃保溫5 h后剩余酶活仍高達67%[18]。

圖6 溫度對重組β-葡萄糖苷酶活性和穩定性的影響Fig.6 Effect of temperatureon the activityand stability of recombinant β-glucosidase

2.3.2 重組β-葡萄糖苷酶的最適反應pH及pH穩定性的研究 酶促反應對pH值的要求很高，不同的pH值對底物與酶的結合率有很大影響，它既影響著底物的解離狀態，又影響酶分子尤其是活性中心的解離狀態。本實驗中研究了不同pH對重組β-葡萄糖苷酶的影響，如圖7（a）所示，重組β-葡萄糖苷酶的最適反應pH約在pH 8.0。在偏酸性條件時，pH 3.0～5.0之間，酶活較低，說明該重組β-葡萄糖苷酶在酸性環境下較為敏感，隨著酸性增強相對酶活下降較快。在pH 6.0～9.0之間時酶活力保持在40%以上，綜上所示，該重組β-葡萄糖苷酶在堿性的環境下酶活力較高。

將相同酶量的酶液在不同pH條件下水浴保溫1 h后，以對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷為底物，在溫度60℃、pH 8.0條件下測定重組β-葡萄糖苷酶的酶活，研究該重組β-葡萄糖苷酶在不同pH條件下的穩定性。以相對酶活作出變化曲線，如圖7（b）所示，發現重組β-葡萄糖苷酶在pH 6.0～9.5之間時較為穩定，剩余酶活在70%以上。在pH 7.0、8.0、8.5、9.0、9.5緩沖液放置1 h后剩余酶活均在90%以上，pH 3.0～5.0時，剩余酶活在40%以下。說明該重組β-葡萄糖苷酶在偏酸性條件下時不太穩定，在中性偏堿性條件下時有非常好的穩定。Mao等人[13]采用大腸桿菌重組表達β-葡萄糖苷酶雖然最適pH值為8.0，但當pH值上升到9.0時，剩余酶活不到40%，且在堿性條件下穩定性較差。作者所構建工程菌表達β-葡萄糖苷酶在堿性條件下的穩定性更好。

圖7 pH對重組β-葡萄糖苷酶活性和穩定性的影響Fig.7 Effectof pH on the activity and stability ofrecombinant β-glucosidase

2.3.3 離子濃度對重組β-葡萄糖苷酶酶活的影響將相同量的酶液加入到終濃度為0.5 mmol/L和5 mmol/L的不同金屬離子溶液中，以對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷為底物測定酶活。測定不同離子濃度的影響時，以不加任何金屬離子的酶液為對照組。作出不同濃度不同金屬離子對酶活的影響，如圖8所示。結果表明，低濃度的金屬離子對重組β-葡萄糖苷酶酶活力的影響并不是太大，只有Ni2+抑制了40%左右。當用5 mmol/L的金屬離子處理時，Cu2+、Fe3+、Zn2+分別抑制了84%、83%和87%的酶活。Mg2+和Mn2+對酶活有促進作用，高濃度的Fe2+、Ca2+對酶活有抑制作用。不同來源的菌株所產生的β-葡萄糖苷酶，金屬離子濃度對酶活的影響差異較大。如深海細菌 Martelella mediterranea[13]，Cu2+和 Zn2+對酶活有強烈的抑制作用，處理后的剩余酶活不到30%，Mg2+和Mn2+對酶活有輕微的抑制作用，K+和Na+作用下可以提高酶活。

圖8 金屬離子對重組β-葡萄糖苷酶酶活的影響Fig.8 Effect of metal ions on the activity of recombinant β-glucosidas

3 結 語

堿性β-葡萄糖苷酶是堿性纖維素酶的重要組成部分，具有廣泛的應用價值，但由于國內對其的研究報道較少，產酶水平較低，作者通過基因工程技術構建異源表達載體 E.coli BL21（DE3）/pColdII-bglA實現堿性β-葡萄糖苷酶的高效表達，經SDS-PAGE結果分析，低溫誘導24 h后，重組β-葡萄糖苷酶主要以可溶性蛋白存在于破碎后的上清液中，粗酶液酶活可達到12.40 U/mL。通過對重組β-葡萄糖苷酶酶學性質的研究，結果表明該β-葡萄糖苷酶的最適反應溫度為60℃，最適反應pH值 8.0， 該重組酶在 pH 7.0、8.0、8.5、9.0、9.5 緩沖液放置1 h后剩余酶活均在90%以上，實驗發現Mg2+和Mn2+對酶活有促進作用，5 mmol/L的Mg2+能提高約50%的相對酶活。5 mmol/L的Fe2+、Ca2+對酶活有抑制作用。

綜上所述，通過對所得重組β-葡萄糖苷酶酶學性質的研究，說明該重組β-葡萄糖苷酶在堿性條件下有較好的穩定性，具有重大研究前景。

由于此堿性β-葡萄糖苷酶的克隆表達尚屬早期研究，相較目前β-葡萄糖苷酶的產酶水平，此重組堿性β-葡萄糖苷酶產量有待進一步提高。對于實現堿性β-葡萄糖苷酶在紡織業、治理環境污染等方面的應用還有待于進一步研究。

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