離子液體環境下淀粉的酶法疏水化改性

袁久剛 ， 向中林 ， 范雪榮 ， 王 強 ， 姚金龍 ， 唐文君 ， 于擁軍

（1.江蘇聯發紡織股份有限公司，江蘇 海安226600；2.江蘇省生態染整技術重點實驗室，江蘇 海安 226600；3.江南大學 紡織服裝學院，江蘇 無錫214122）

淀粉是一種來源豐富、生物可降解的天然高分子多聚物。但是原淀粉只具有單一的親水性，在用作某些特殊工業材料，如合成纖維上漿劑、食品穩定劑、污水吸附劑以及包裝材料時，原淀粉這種親水性過強的缺點就暴露無疑，大大限制了其應用。因此，要想提高其應用性能，仍然需要對其進行疏水化改性。目前淀粉的改性主要是在淀粉主鏈上引入一些具有疏水性質的基團，如長鏈烷基脂肪酸[1]、烯基琥珀酸基團[2]以及一些可降解的環狀內酯單體，如己內酯[3]，從而使淀粉具有乳化、增溶、吸附以及可塑性等優良性能。

采用脂肪酶進行生物催化淀粉接枝是目前國內外研究的一個新方向。與普通化學法相比，脂肪酶催化接枝具有效率高、反應條件溫和以及無重金屬離子殘留等優點；此外，脂肪酶在催化過程中還可以避免酸試劑加入對淀粉大分子降解的影響[4-6]。但是，采用脂肪酶進行淀粉催化酯化反應需在無水以及微水環境中進行，例如：2008年，趙秀娟等[7]用脂肪酶Lipozyme TLIM在無溶劑體系中催化合成硬脂酸大米淀粉酯，并優化工藝條件，獲得取代度最大為0.218 8。Rajan等[8]在DMSO/DMF有機溶劑的反應體系中，以脂肪酶為催化劑催化了木薯淀粉和棕櫚酸的合成反應，通過皂化法測得取代度為1.05。陳鳳[9]在有機溶劑DMSO中，用Novozym 435催化羥乙基淀粉接枝丙交酯，研究了不同反應條件下的接枝質量比，得到最大值為52%。隨著酶在多種不同溶劑體系中的研究進展，研究者們發現了很多問題，比如有機溶劑造成的環境污染，以及如何做到既能很好的溶解底物又能保持較高的酶活性等。所以，尋找一種新型的綠色反應介質來替代傳統揮發性有機溶劑，逐漸成為研究者關注的新方向。

早在2003年Sheldon[10]及其同事就對離子液體中的脂肪酶催化進行了研究，結果表明脂肪酶在某些離子液體，如1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（[BMIM]PF6）和1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（[EMIM]BF4）中具有與在有機溶劑中一樣的催化活性。Chen Z G等[11]研究表明，脂肪酶在離子液體中催化魔芋甘聚糖?；磻獣r比在叔丁醇中的活性和穩定性還高；此外，Lu X X等[12]還發現部分混合離子液體對淀粉具有更好的溶解能力，可以顯著提高淀粉的接枝率。與有機溶劑相比，離子液體是完全由離子組成的室溫熔融鹽，還具有無毒、蒸汽壓低，不易燃，耐高溫、化學性質穩定以及回收方便等特點[13]，因此，這使其成為生物酶催化的理想非水反應介質。

本課題擬以離子液體為反應介質，通過非水相體系下的脂肪酶催化酯化反應，將月桂酸接枝到淀粉大分子上，從而實現對淀粉的疏水化改性，改善淀粉的應用性能。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

普通玉米淀粉（食品級），大慶展華生化科技有限公司產品；脂肪酶Novozym 435（工業級，酶活：16 000 NHU/g），諾維信有限公司產品；月桂酸（分析純），國藥集團化學試劑有限公司產品；離子液體（工業級），河南麗華制藥有限公司產品；其他化學試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司，分析純級。

1.2 實驗儀器

Rapid振蕩水浴鍋，廈門瑞比公司產品；DZF-6050真空干燥箱，鄭州南北儀器設備有限公司產品；NDJ-79旋轉粘度計，上海昌吉地質儀器有限公司產品；NICOLET iS10 FT-IR傅立葉紅外分析儀，Thermo Fisher公司產品；SU1510掃描電子顯微鏡，日本日立株式會社產品；Q200差示掃描量熱儀，美國TA儀器公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 再生淀粉的制備 稱取1 g烘干淀粉，在120℃恒溫加熱攪拌下，分批加入到1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽（[BMIM]Cl）中，直至完全溶解，待溶液冷卻后加入無水乙醇進行離心，沉淀于40℃真空干燥，得到再生淀粉。

1.3.2 月桂酸淀粉酯的制備 將再生淀粉與離子液體（[BMIM]BF4或者[BMIM]PF6）混合均勻后，依次加入月桂酸 （月桂酸/AGU摩爾比3∶1）、脂肪酶200 mg，充氮氣后密封，于60℃條件下，恒溫反應4 h。反應結束后，先加入甲醇過濾去除酶，再利用10倍甲醇多次洗滌、離心，去除上清液，得到的沉淀在40℃下真空干燥。

1.3.3 取代度測定 采用酸堿滴定方法進行測定，具體操作方法按照參考文獻[12]所述步驟進行。

1.3.4 紅外測試 稱取約2 mg樣品與KBr粉末混勻后放置在壓片機上，制成透明薄片。先采集背景，然后測試，掃描次數32次，掃描范圍500～4 000 cm-1，分辨率8 cm-1。

1.3.5 電鏡分析 將淀粉顆粒用雙面膠固定在塑料薄膜上，表面噴金后，采用SU1510掃描電鏡進行測試，電壓5 kV，放大倍數1 000～2 000倍。

1.3.6 粘度、透光率的測定 分別稱取一定量的淀粉樣品，配制質量濃度為10 g/L的溶液，于95℃加熱攪拌使其完全糊化，然后在該溫度下利用粘度儀測其粘度，冷卻至室溫后，于波長580 nm處測定透光率。

1.3.7 接觸角測量 稱取1 g淀粉樣品，在壓片機上壓制成膜，然后放在載玻片上，利用接觸角測量儀上進行水滴接觸角測量，每個樣品測試5次，最后取平均值。

1.3.8 DSC分析 稱取5 mg干燥樣品放入坩堝中，加蓋后卷邊壓緊，設置溫度為20～200℃，升溫速率10℃/min，開始升溫測試。

2 結果與討論

2.1 溶劑體系對月桂酸淀粉酯取代度的影響

脂肪酶催化酯類的合成通常需要無水或微水環境，溶劑的親疏水性質、脂肪酶以及底物在不同的溶劑體系中溶解或分散狀態都會直接影響酶的催化活性。本文中分別選取了常見的幾種非水介質：無溶劑、丙酮以及2種離子液體[BMIM]BF4和[BMIM]PF6用于脂肪酶催化反應。對不同反應體系得到的接枝淀粉進行取代度測試，結果如圖1所示。

圖1 溶劑體系對月桂酸淀粉酯取代度的影響Fig.1 Effect of solvent systems on DS values of laurate starch

如圖1所示，在所選的4種非水相體系中，脂肪酶均能催化月桂酸對淀粉進行接枝。其中，在離子液體中表現出最好的催化能力，其產物取代度最高。這是因為離子液體對底物的溶解性比丙酮以及無溶劑系統都要好，而且親水性的[BMIM]BF4離子液體又比疏水性的 [BMIM]PF6離子液體效果更顯著。通過以上對比，可以看出對淀粉有一定溶解能力的 [BMIM]BF4離子液體比較適合作為Novozym 435脂肪酶催化月桂酸接枝淀粉的反應介質。

2.2 紅外分析

對原淀粉、再生淀粉以及在 [BMIM]BF4和[BMIM]PF6中合成的月桂酸淀粉酯分別進行紅外分析，結果如圖2所示。

圖2 紅外光譜分析Fig.2 IR analysis

從圖2可以看出再生淀粉（b）與原淀粉（a）紅外吸收峰基本相同，其中位于3 398 cm-1和2 927 cm-1處分別對應的是-OH以及-CH的伸縮振動峰。另外，在1 083、1 058 cm-1和1 021 cm-1指紋區出現的吸收峰為淀粉顆粒中葡萄糖苷基AGU的C-O伸縮振動吸收峰。與原淀粉相比，月桂酸接枝淀粉除了具有淀粉葡萄糖苷基AGU的結構特征峰外，還在1 726 cm-1出現了明顯的C=O伸縮振動吸收峰，這是酯鍵的特征吸收峰，這充分表明淀粉分子鏈中的葡萄糖苷基AGU上部分-OH發生了取代反應，通過脂肪酶的酯化在其羥基上成功引入了月桂酸酯基團。

2.3 接枝淀粉的疏水性能

對原淀粉、再生淀粉和不同取代度接枝淀粉的水滴潤濕接觸角分別進行測定，結果如表1所示。

表1 水滴潤濕接觸角分析Table 1 Water contact angle analysis

從表1可以看出，與原淀粉相比，再生淀粉的水滴潤濕接觸角略有降低，這是因為經過溶解后淀粉顆粒遭到破壞，其親水性變好。經月桂酸接枝改性后的淀粉，其水滴潤濕接觸角明顯增大，而且隨著取代度的增加，接觸角增加越顯著。這說明淀粉分子上的羥基被長碳鏈脂肪酸單體取代越多，接枝淀粉的疏水性就越高。

2.4 接枝淀粉的耐熱性能

分別對原淀粉、再生淀粉和接枝淀粉進行DSC測試，結果如圖3所示。

圖3DSC分析Fig.3 DSC analysis of starch， regenerated starch，laurate starch

從圖3可以看出，3種樣品均在110～125℃出現了一個熔融吸熱峰，這是升溫過程中，淀粉顆粒轉變為糊化狀態所引起。相對于原淀粉，再生淀粉的吸熱峰溫度降低，這是因為淀粉顆粒在溶解過程中遭到了破壞（見圖4），而接枝淀粉的吸熱峰值溫度升高，這是由于接枝過程中疏水性基團的引入，使得淀粉大分子鏈上的羥基被取代，淀粉的吸水性能降低所致。

2.5 接枝淀粉粘度和透光率變化

對原淀粉和接枝淀粉分別糊化后的粘度和透光率進行測定，結果如表2所示。

表2 原淀粉和改性淀粉粘度、透光率Table2 Viscosity and transmittanceofstarch and modified starch

從表2可以看出：經糊化后的接枝淀粉，其粘度和透光率都比原淀粉有所降低，這是因為，月桂酸的引入會使原來淀粉分子之間較強的氫鍵作用減弱，淀粉大分子鏈變得松弛，因此，糊化后粘度會降低。此外，由于接枝淀粉的疏水性增強，導致淀粉分子和水結合比較困難，光線在經過時反射和透射強度均減弱，從而導致接枝淀粉的透光率降低。

2.6 接枝淀粉的表觀形貌

分別對原淀粉、再生淀粉和接枝淀粉進行掃描電鏡測試，結果如圖4所示。

圖4 原淀粉，再生淀粉和接枝淀粉的掃描電鏡圖Fig.4 SEM photos of starch，regenerated starch and modified starch

從圖4中可以看出，原淀粉是由許多光滑的球形顆粒組成，大小不同但形狀規則。而經過[BMIM]Cl溶解之后得到的再生淀粉，其顆粒形狀已經被完全破壞，這是由于淀粉分子經過溶解再生，其晶區被破壞，所以分子之間變得松散。接枝淀粉的形貌與再生淀粉相似，但接枝淀粉由于疏水性基團的引入使其分子間變得更為松散，呈現出不規則片狀結構。

3 結 語

根據以上研究可以看出，相比于傳統的非水相體系，脂肪酶在離子液體中具有更高的催化活性，而且在親水性的[BMIM]BF4離子液體中得到產物取代度更高。當淀粉上的羥基被月桂酸取代后，其疏水性快速增加，導致淀粉糊化變難，但是由于月桂酸的引入，使得大分子間的氫鍵作用減弱，因此糊化后淀粉粘度下降。同時，月桂酸的引入也導致大分子鏈變得松弛，淀粉顆粒呈現出不規則的片狀結構。

[1]WANG Yan，XIN Jiaying，WU Wenlong.The properties of enzymatic synthesis medium-long chain fatty acid esterification of starch[J].Journal of the Chinese Cereals and Oils Association，2015，30（4）：11-17.（in Chinese）

[2]WANG X Y，LI X X，CHEN L，et al.Preparation and characterization of octenyl succinate starch as a delivery carrier for bioactive food components[J].Food Chemistry，2011，126（3）：1218-1225.

[3]XU Ling，YANG Cheng，DUAN Bin，JIANG Chao.Synthesis of starch-grafted-polycaprolactone copolymer with lipase as catalyze[J].Polymer Materials Science and Engineering，2009，25（7）：34-37.（in Chinese）

[4]QIAO L，GU Q M，CHENG H N.Enzyme-catalyzed synthesis of hydrophobically modified starch[J].Carbohydrate Polymers，2006，66（1）：135-140.

[5]XU J，ZHOU C W，WANG R Z，et al.Lipase-coupling esterification of starch with octenyl succinic anhydride[J].Carbohydrate Polymers，2012，87（3）：2137-2144.

[6]HORCHANI H，CHAABOUNI M，GARGOURI Y，et al.Solvent-free lipase-catalyzed synthesis of long-chain starch esters using microwave heating：optimization by response surface methodology[J].Carbohydrate Polymers，2010，79（2）：466-474.

[7]ZHAO Xiujuan，YU Guoping.Study on synthesis of stearate starch by using immobilized lipase[J].Journal of Northeast Agricultural University，2008，39（10）：89-93.（in Chinese）

[8]RAJAN A，SUDHA J D，ABRAHAM T E.Enzymatic modification of cassava starch by fungal lipase[J].Industrial Crops and Products，2008，27（1）：50-59.

[9]CHEN Feng，YANG Cheng.Synthesis of hydroxyethyl starch lactide graft polymer by enzyme catalysis[J].Applied Chemical Industry，2009，38（8）：1109-1111.（in Chinese）

[10]RANTWIJK F V，LAU R M，SHELDON R A.Biocatalytic transformations in ionic liquids[J].Trends in Biotechnology，2003，21（3）：131-138.

[11]CHEN Z G，ZONG M H，LI G J.Lipase-catalyzed acylation of konjacglucomannan in ionic liquids[J].Journal of Chemical Technology and Biotechnology，2006（81）：1225-1231.

[12]LU X X，LUO Z G，YU S J，et al.Lipase-catalyzed synthesis of starch palmitate in mixed ionic liquids[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2012，60（36）：9273-9279.

[13]HOLBERY J D，SEDDON K R.Ionic liquids[J].Clean Products and Processes，1999，1（4）：223-236.