紫外分光光度法測定西藏林芝當歸根中總黃酮含量△

李　捷　陳依春　賀　學　王世華　張景瑜　吳曉軍　張雪偉　姚　歡　巴桑次仁　色里瑪　孫芳云*

(1.西藏民族大學基礎醫學院生命科學基礎研究實驗室、藏藥篩選實驗室，陜西　咸陽　712082;　2.西藏甘露藏藥股份有限公司，西藏　拉薩　851400)

當歸,藏名當庚,為傘形科植物當歸的干燥根，生長于海拔2800～4900m高寒陰濕的山坡及林緣，《藏醫百科全書》記載,藥性味辛性涼。據初步考證西藏當歸分布于林芝、昌都、拉薩、日喀則、那曲等地?！毒е楸静荨酚涊d：當庚清心熱，解毒。藏醫藥記載，西藏當歸是傳統藏藥，有補血、養血滋補、活血化瘀、調經止痛等作用。

當歸的化學成分主要有多糖類、苯酞類、香豆素類、阿魏酸鈉、黃酮類、揮發油類化合物及其他成分[1-2]。黃酮類化合物是其主要有效成分之一，黃酮類化合物泛指2個具有酚輕基的苯環通過中央三碳原子相互連接而成的一系列化合物[3]。有研究表明,黃酮類化合物有抗氧化、抗炎、鎮痛、調節免疫、抗衰老、降血脂作用[4]。實驗表明，從當歸中分離到的黃酮類化合物具有抑制NO生成、抗氧化和抑菌殺菌等作用[5-7]。西藏當歸中是否含有黃酮類物質未見報道，我們利用西藏林芝種植當歸根,對其總黃酮含量進行了測定，為進一步研究西藏當歸的藥理作用提供理論依據。

1　實驗材料

1.1儀器紫外分光光度計(美國PE lambda-25)，電子分析天平(T-214萬分天平)，超聲提取儀(型號HAD-SY-800，長春樂璞科技有限公司)，低溫室不銹鋼藥品柜(SC18CM4門冰箱)。

1.2試劑蘆丁對照品(供UV法含量測定用)：100080-201610，100mg/支，中國食品藥品檢定研究院提供。三氯化鋁：AR，20161008，天津市天力化學試劑有限公司；亞硝酸鈉：分析純，20161020，河南焦作市化工三廠；氫氧化鈉：分析純，西安化學試劑廠；無水乙醇：分析純，20160626，天津市河東區紅巖試劑廠。

1.3藥材西藏林芝2017年當歸根，由西藏甘露藏藥廠提供。

2　方法與結果

2.1林芝當歸根總黃酮的提取工藝精密稱取西藏林芝2017年當歸根粗粉1g, 置于500mL圓底燒瓶, 加入75%酒精60mL和玻璃珠少許，浸泡20min后，加熱保持沸騰回流1h，冷卻后抽濾得濾液，濾渣再次加入60mL 75%酒精浸泡20min后沸騰回流1h ，冷卻抽濾，合并兩次濾液。將濾液水浴濃縮至僅剩5mL，轉入25mL容量瓶中，用75%酒精稀釋定容至刻度，得樣品提取原液。

2.2對照品溶液的制備精密稱取在120℃減壓干燥至恒重的蘆丁對照品28.66mg，置25mL容量瓶中, 用無水乙醇定容。精密量取10.00 mL蘆丁對照品溶液于50mL容量瓶, 用無水乙醇稀釋、定容,搖勻即得蘆丁對照品溶液(0.22928mg/mL)。

2.3測定波長的選擇精密移取對照品溶液2.00mL置25mL容量瓶中,按順序依次加入5%NaNO2溶液1mL，搖勻,放置6min,加10% AlCl3溶液1mL搖勻,放置6min,再加入4% NaOH溶液10mL,加蒸餾水稀釋至刻度,搖勻，放置15min。精密移取蒸餾水2.00mL，同法配制25mL混合溶液作為空白對照,在200～700nm范圍內進行掃描,確定蘆丁顯色液的最大吸收波長為509nm。

2.4標準曲線的制備精密移取蘆丁對照品溶液1.00mL， 2.00mL， 3.00mL， 4.00mL，5.00mL， 6.00mL,分別置于25mL容量瓶中，按順序依次加入5%NaNO2溶液1mL，搖勻,放置6min,加10% AlCl3溶液1mL搖勻,放置6 min,再加入4% NaOH溶液10mL,并加蒸餾水稀釋至刻度,搖勻，放置15min。在波長為509nm處進行檢測，然后以吸光度為縱坐標,濃度為橫坐標繪制標準曲線，最小二乘法直線回歸，得蘆丁回歸方程為:A=13.324·C-0.1253，A 為吸光度，C為質量濃度，R2=0.9984，n=5。實驗表明蘆丁在9.17～55.0μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.5精密度試驗精密量取配置好的西藏林芝2017年當歸根樣品溶液2.00mL，其余同2.3項下操作,測定吸光度,重復測定6次,結果表明,RSD=1.9%,說明該方法精密度良好。

2.6穩定性試驗精密量取配置好的西藏林芝2017年當歸根樣品溶液2.00mL，其余同2.3項下操作,每隔15min測定一次吸光度,重復測定6次，結果表明,樣品吸光度在60min內穩定，RSD=2.1%，說明該方法穩定性良好。

2.7重復性試驗平行取西藏林芝2017年當歸根藥材粉末1g各5份，按2.1項下方法制備樣品原液。精密量取2.00mL，其余同2.3項下操作,測定吸光度,林芝根RSD=2.37%，表明該方法重復性良好。

2.8回收率試驗精密吸取對照品溶液(濃度為0.1mg/mL)0.2mL,0.3mL各2份,置25mL容量瓶中，分別加入已知含量的西藏林芝根(已測得其總黃酮含量為2.53mg/mL)樣品溶液2.00mL,其余按2.3項下進行測定回收率為101.5%，RSD=0.8%，表明該方法科學合理。

3　樣品含量測定結果

取西藏林芝2017年當歸根藥材粉末1g，按2.1項下方法制備樣品溶液。精密移取林芝根樣品原液2.00mL，其余按2.3項下方法測定吸光度,代入回歸方程中。

樣品中總黃酮含量計算公式：由線性方程A=13.324·C-0.1253得出。西藏林芝2017年當歸根莖中總黃酮的含量測定分別為2.653 mg/g 、2.668 mg/g、2.534 mg/g、2.530 mg/g、2.633 mg/g ，總黃酮均值計算為2.604mg/g。

4　討論

有文獻報道當歸總黃酮提取工藝中，乙醇回流法為當歸總黃酮的最適提取方法[8]。本人利用現有的實驗室條件，以蘆丁標準品為對照，經全波長掃描確定最大吸收波長分別為509 nm，在9.17～55.0μg/mL范圍內呈現良好的線性關系,回歸方程為: A=13.324·C-0.1253, R2=0.9984,n=5, A為吸光度，C為質量濃度，總黃酮回收率為101.5%，在該工藝條件下提取林芝當歸總黃酮，得當歸總黃酮含量為2.604mg/g。

本研究采用紫外分光光度法回對西藏林芝當歸根中總黃酮進行測定，方法學考察顯示，該方法顯色穩定，重復性、精密度及回收率均達到定量分析的要求，且簡便易行，數據較為合理可靠，可用于當歸藥材的日常檢驗和質量控制。