朝醫(yī)傳統(tǒng)方劑千金文武湯提取和精制工藝研究△

周　婷　劉　賀　郭建鵬

(1.長(zhǎng)白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(延邊大學(xué))，吉林　延吉　133002；　2.浙江華海藥業(yè)股份有限公司，浙江　臨海　317000)

朝醫(yī)傳統(tǒng)方“千金文武湯”(《東醫(yī)四象新編》元成庵)由葛根、黃芩、山藥、藁本、五味子、桔梗、升麻、白芷、麥門(mén)冬等藥味組成[1]，具有補(bǔ)肺斂肺，養(yǎng)胃生津，健脾固腎，利水消腫的功效。原方為水煎煮制備的湯劑，在劑型和生產(chǎn)工藝方面存在著一定局限性。

本文在不改變生產(chǎn)工藝性質(zhì)的前提下，對(duì)“千金文武湯”提取和精制工藝進(jìn)行研究，以藥味中主要有效成分總多糖、總黃酮和總皂苷的提取量和保留率為指標(biāo)，考察主要影響因素對(duì)提取量和保留率的影響，優(yōu)選最佳工藝參數(shù)。

1　材料與儀器

1.1藥材與試劑：方中葛根、山藥、黃芩、藁本、五味子、桔梗、升麻、白芷、麥門(mén)冬等藥材飲片由北京同仁堂(延吉)有限公司提供；ZTC1+1天然澄清劑(北京正天澄清劑技術(shù)有限公司，20150910)；其他試劑均為分析純.

1.2主要儀器與設(shè)備：主要儀器有：提取濃縮機(jī)組(HZ-tqn-20L,上海輝展實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),紫外分光光度計(jì)(D-1900，日本日立公司)，電子天平(FA2004，上海良平儀器儀表有限公司)，循環(huán)水式多用真空泵(SHB-Ⅲ，鄭州長(zhǎng)城儀器廠(chǎng))，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R206，上海申生儀器廠(chǎng))，電子調(diào)溫電熱套(98-1-B型，天津市泰斯特儀器有限公司)，恒溫水浴鍋 (金壇市恒豐儀器廠(chǎng))。

2　方法與結(jié)果

2.1總黃酮含量測(cè)定方法學(xué)考察采取紫外分光光度法，測(cè)定復(fù)方提取液中總黃酮的含量[2]。

2.1.1溶液配制

2.1.1.1對(duì)照品溶液精密稱(chēng)量蘆丁對(duì)照品適量，加入甲醇配至濃度為0.2 mg/mL。

2.1.1.2供試品溶液精密量取樣品液1mL，用提取溶液稀釋10倍，搖勻。

2.1.2檢測(cè)波長(zhǎng)的確定精密量取蘆丁對(duì)照品溶液2 mL，置于25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6min，加入1mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻放置6min，繼續(xù)加入10mL 5%氫氧化鈉試液，搖勻，加水定容，混勻后放置15min，經(jīng)紫外分光光度計(jì)掃描，確定檢測(cè)波長(zhǎng)定為510nm。

2.1.3線(xiàn)性關(guān)系考察線(xiàn)性回歸方程為：Y=0.0008X+0.0029,r=0.9998。結(jié)果表明，在115～690μgmL-1范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.1.4精密度考察RSD值為0.281%，儀器精密度良好。

2.1.5穩(wěn)定性考察RSD值為1.338%，供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.1.6加樣回收率考察平均回收率為99.56%，RSD值為0.74%，本實(shí)驗(yàn)方法具有較好的準(zhǔn)確度及可行性。

2.2多糖含量測(cè)定方法學(xué)考察采取蒽酮-硫酸比色法[3]，測(cè)定復(fù)方提取液中總黃酮的含量。

2.2.1溶液配制

2.2.1.1蒽酮-硫酸溶液：量取蒽酮0.2g，加濃硫酸100mL，混勻。

2.2.1.2對(duì)照品溶液：精確稱(chēng)取葡萄糖對(duì)照品，置100mL容量瓶中,蒸餾水溶解稀釋至刻度，精密吸取10mL置100mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻。

2.2.1.3供試品溶液：取樣品液50mL，加入乙醇至醇含量在80%以上，不斷攪拌至大量沉淀生成，靜置12h，離心，收集沉淀，用蒸餾水溶解，濾過(guò)，濾液定容至100mL，搖勻。

2.2.2檢測(cè)波長(zhǎng)的確定量取0.1，0.3，0.5，0.7，0.9mL葡萄糖對(duì)照品溶液，加水補(bǔ)足至1mL，搖勻，置于具塞試管中，加5mL蒽酮試劑，混勻,加塞密封，置于沸水浴中8min，取出冷卻，靜置10min。經(jīng)紫外分光光度計(jì)掃描，確定檢測(cè)波長(zhǎng)為580nm。

2.2.3線(xiàn)性關(guān)系考察線(xiàn)性回歸方程為：Y=0.0069X-0.0128，r=0.9998結(jié)果表明，在10.4～93.6μgmL-1范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2.4精密度考察RSD值為0.061%，儀器精密度良好。

2.2.5穩(wěn)定性考察RSD值為0.509%,在一定時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6加樣回收率考察總多糖平均回收率為99.43%，RSD值為0.42%，本實(shí)驗(yàn)方法具有較好的準(zhǔn)確度及可行性。

2.3皂苷含量測(cè)定方法學(xué)考察采用紫外分光光度法，測(cè)定萃取后皂苷類(lèi)成分吸光度值[4]。

2.3.1溶液配制

2.3.1.1對(duì)照品溶液精密稱(chēng)取三七皂苷標(biāo)準(zhǔn)品5mg，置于25mL容量瓶中，用甲醇溶解至刻度。

2.3.1.2供試品溶液精密量取樣品液10mL，置于分液漏斗中，加水至25mL，進(jìn)行萃取。加入水飽和正丁醇溶，振搖萃取3次，每次20mL，分別取正丁醇層，合并。用氨試液洗滌3次，每次20mL，取正丁醇層蒸干，甲醇溶解其殘?jiān)浦?5mL量瓶中，定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液。

2.3.2檢測(cè)波長(zhǎng)的確定精密量取三七皂苷對(duì)照品溶液1mL，置10mL具塞試管中，蒸干溶劑，精密量取0.2mL5%香草醛-冰乙酸溶液，加入0.8mL高氯酸，混勻至殘?jiān)芙猓?0℃水浴中，加熱10min后取出冷卻，加5mL冰乙酸，搖勻。經(jīng)紫外分光光度計(jì)掃描，確定檢測(cè)波長(zhǎng)為560n。

2.3.3線(xiàn)性關(guān)系考察線(xiàn)性回歸方程為：Y=0.0039X-0.0298，r=0.9994。結(jié)果表明，19.2～96μgmL-1范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.3.4精密度考察RSD值為0.133%，儀器精密度良好。

2.3.5穩(wěn)定性考察RSD值為1.066%，待測(cè)樣品液在一定時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6加樣回收率考察總皂苷平均回收率為100.13%，RSD值為0.67%，本實(shí)驗(yàn)方法具有較好的準(zhǔn)確度及可行性。

2.4提取工藝研究

2.4.1提取方法取葛根10g、黃芩10g、山藥10g、藁本10g、五味子5g、桔梗5g、升麻5g、白芷5g、麥門(mén)冬5g置圓底燒瓶中，浸泡1h，水煎煮提取2次，提取液濃縮定容至650mL。

2.4.2工藝參數(shù)優(yōu)選以提取時(shí)間和溶劑用量為考察因素，總黃酮、總多糖和總皂苷提取量的綜合評(píng)分為指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)選工藝參數(shù)[5]。因素水平見(jiàn)表1。試驗(yàn)方案見(jiàn)表2。方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。綜合評(píng)分計(jì)算方法：綜合分?jǐn)?shù) =(總黃酮含量/最大總黃酮含量)×40值+(總多糖含量值/最大總多糖含量)×30+(總皂苷含量值/最大總皂苷含量)×30。

方差分析結(jié)果表明，因素A對(duì)綜合評(píng)分有顯著性影響，B無(wú)顯著性影響，進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，B1 與B2無(wú)顯著差異，B2> B3并具有顯著差異，故確定的最佳提取方案為A1B2，即煎煮時(shí)間為120 min，90 min；溶劑用量為10，8倍。

表1　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果

表3　綜合評(píng)分結(jié)果方差分析結(jié)果

2.4.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)： 取同批次藥材3份按最佳工藝進(jìn)行提取，綜合評(píng)分平均值為97，與正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果最大值接近，表明優(yōu)化后提取工藝穩(wěn)定可行。

表4　最佳工藝綜合評(píng)分

3　精制工藝研究

采用吸附澄清法對(duì)提取液精制[6]，選擇ZTC1+1天然澄清劑，以精制液的澄明度為指標(biāo)，考察澄清劑的用法用量，提取液濃縮程度、溫度對(duì)精制效果的影響。

3.1澄清劑的配制A組分：取A組份適量，加入少量蒸餾水，攪拌成糊狀，加蒸餾水，靜置24 h，配制成1%粘膠液。

B組分：取B組份適量，加入少量的1%醋酸溶液，攪拌成糊狀，加入1%乙酸溶液，靜置24 h，配制成1%粘膠液。

3.2吸附澄清劑的用法、用量對(duì)澄清工藝的影響分別考察吸附澄清劑4種不同用法對(duì)藥液澄清效果的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。

用法1：提取液濃縮至料液比為1:2，60℃，加入A組分，用量為藥液的8%，邊加邊攪拌，靜置24h，濾過(guò)。

用法2：提取液濃縮至料液比為1:2，60℃，加入B組分8%，用量為藥液的8%，邊加邊攪拌，靜置24h，濾過(guò)。

用法3：提取液濃縮至料液比為1:2，60℃，先加入A組分，用量為藥液的8%，邊加邊攪拌，靜置24h，濾過(guò)，加入B組分，用量為A組分的0.5倍，靜置6h，濾過(guò)。

用法4：提取液濃縮至料液比為1:2，60℃，先加入B組分，用量為藥液的8%，邊加邊攪拌，靜置24h，濾過(guò)，加入A組分，用量為B組分的0.5倍，靜置6h，濾過(guò)。

表5　吸附澄清劑的用法對(duì)藥液澄明度的影響

注：+++嚴(yán)重渾濁 ++渾濁 +輕微渾濁-澄明

表5結(jié)果表明，吸附澄清劑的不同用法對(duì)澄明度影響顯著，用法4的澄清效果最佳。在此基礎(chǔ)上對(duì)澄清劑用量進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果表明，B組分用量為藥液量的7%、8%時(shí)澄明度良好，故確定 B組分用量為7%。

表6　澄清劑B組分用量對(duì)藥液澄明度的影響

3.3藥液濃縮程度對(duì)澄清工藝的影響將提取液濃縮至不同程度，進(jìn)行吸附澄清，結(jié)果見(jiàn)表7。結(jié)果表明，藥液濃縮至料液比為1:1時(shí)澄清效果最佳。

表7　藥液濃縮程度對(duì)藥液澄明度的影響

3.4溫度對(duì)澄清工藝的影響：將藥液控制在不同溫度，進(jìn)行吸附澄清，結(jié)果見(jiàn)表8。結(jié)果表明，藥液控制在60℃時(shí)澄清效果最佳。

表8　藥液溫度對(duì)藥液澄明度的影響

3.5精制前后對(duì)比考察采用上述優(yōu)選澄清工藝參數(shù)對(duì)提取液進(jìn)行精制，測(cè)定精制前后提取液的浸膏得率、總黃酮、總多糖和總皂苷含量，結(jié)果見(jiàn)表9。結(jié)果表明，精制后提取液的浸膏得率顯著下降，總黃酮、總多糖及總皂苷的保留率均在85%以上，表明采用該精制工藝可行。

表9　精制前后提取液的浸膏得率及有效成分含量

4　討論

綜合評(píng)分法可以同時(shí)兼顧多項(xiàng)指標(biāo)對(duì)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平的影響，有利于全面評(píng)價(jià)結(jié)果，適合應(yīng)用于中藥提取工藝的優(yōu)選實(shí)驗(yàn)中。

傳統(tǒng)復(fù)方制劑成分復(fù)雜，采用吸附澄清法對(duì)提取液進(jìn)行精制，浸膏得率降低，減少了使用劑量；同時(shí)主要成分保留率較高，臨床療效得到保障。

“千金文武湯”最佳提取工藝參數(shù)為水煎煮法提取2次，料液比1 : 10、2h，料液比1 : 8、1.5h；最佳精制工藝參數(shù)為：料液比為1 : 1，吸附澄清劑B組分用量為7%，吸附澄清劑A組分用量為3.5%，藥液溫度60℃。