FTIR結合化學計量學快速預測鐵皮石斛中總多糖含量

曾 貞，孫 恒*，陳駿飛，徐天才，王宇萍，李 坤，康平德**，胡 強

(1.云南省農業科學院 高山經濟植物研究所，云南 麗江 674199；2.云南省農業科學院 熱區生態農業研究所，云南 元謀 651300；3.云南省農業科學院，云南 昆明 650000)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)多年生附生草本植物，主要分布在我國云貴、兩廣、浙江、湖南等地區[1]。有研究表明：鐵皮石斛含有豐富的多糖、芪類、黃酮、多酚等多種化學成分[2-5]?！吨袊幍洹酚涊d：具有益胃生津，滋陰清熱之功效；用于熱病津傷，口干煩渴等癥[6]。現代藥理學認為：鐵皮石斛多糖具有提高機體免疫能力[7]、抗氧化[8]、抗疲勞[9]、抗腫瘤[10]等藥理活性。多糖作為評價鐵皮石斛質量的指標性成分，對其含量預測具有重要意義。

傅里葉變換紅外光譜(FTIR)為分子振-轉光譜，能夠提供豐富的峰位、峰強和峰形信息，具有加合性，反映藥材整體質量，克服單方面定性和定量研究的不足，有紅外光譜指紋圖譜和全息光譜之稱特征性強、快速、無損和簡便等優點，能夠反映樣品化學成分整體信息[11]，Luís M等[12]基于傅里葉變換近紅外光譜對廢棄咖啡中咖啡因、咖啡酸、兒茶酸、綠原酸和茶堿的定量分析，結果偏最小二乘回歸分析(PLSR)模型預測集相關系數Rp2分別為0.95、0.92、0.88、071、0.84，表明能良好預測廢棄咖啡中相關成分含量，Daniela等[13]用FTIR鑒別塑料、薄膜和泡沫，結果顯示：PCA分析能很好地區分3種樣品；楊天偉等[14]用FTIR建立馬氏距離分類模型及偏最小二乘判別分析快速鑒別不同種類牛肝菌，結果顯示：MSC+SD+ND(15∶5)和SNV+SD+ND(15∶5)2種預處理的驗證集和預測準確率分別為90%和95%，此外，紅外光譜還廣泛運用于食品[15-16]和中藥[17]的鑒定及預測分析中。紫外光譜為電子光譜，常用于水質[18]、食用油[19]、飲料[20]、中藥[21]的定量測定及質量控制分析，但其操作繁雜，存在化學污染。

本研究運用紫外可見分光光度計測定不同采收時間的樣品粗多糖吸光度，同時使用紅外光譜采集樣品光譜數據，擬合紫外、紅外數據，用FTIR結合化學計量學對鐵皮石斛多糖進行了快速預測。建立快速的鐵皮石斛粗多糖預測模型，為企業采收鐵皮石斛和生產線石斛多糖質量控制提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取種源相同的鐵皮石斛種苗，并經筆者反復核實鑒定為鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)，2011年4月定植于玉溪市紅塔區祥馨農產品種植基地，2014年1～12月的每月15日采收鮮條，60 ℃鼓風干燥5 d，粉碎過60目篩備用。

1.2 儀器與試劑

Perkin-Elmer Fronter型傅里葉紅外光譜儀，DTGS檢測器，光譜范圍4000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，信號累加掃描16次。壓片機為YP-2(上海山岳科學儀器儀器公司)。UV─2550雙通道紫外可見分光光度計，配有UVprobe工作站使用說明書，由日本島津公司生產。KBr為分析純，購于天津市風船化學試劑科技有限公司。H2SO4為分析純，購于成都市科龍化工試劑廠。CH3CH2OH(無水乙醇)，為分析純，購于西隴化工股份有限公司。無水葡萄糖超純級CAS:50-99-7，購于Sigma-Aldrich公司。C6H5OH(苯酚)為分析純，購于西隴化工股份有限公司。

1.3 紅外光譜掃描

取樣品與KBr粉末(1∶100)混合研磨均勻，壓制均勻成透明薄片，放入紅外光譜儀中測定。紅外光譜采集過程中室溫保持在25 ℃，空氣相對濕度保持在40%～48%。

1.4 鐵皮石斛總多糖的測定方法

1.4.1 標準溶液制備 取無水葡萄糖對照品18 mg，精密稱取，加水定容制成90 μg/mL的溶液。

1.4.2 標準曲線制作 精密量取標準溶液0.1～1.0 mL分別放置于試管中，用移液槍補超純水至1.0 mL，加5%苯酚1 mL，搖勻，加硫酸5 mL搖勻，沸水水浴20 min，取出，冷水浴5 min，以相應試劑為空白，進UV─2550紫外光度計，測量吸光度，對比樣品和標準品，確定最適吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.4.3 樣品多糖溶液制備 取過60目篩的樣品粉末(0.0600±0.0001) g，加超純水30 mL水浴超聲2 h，過濾，取濾液2 mL，加無水乙醇至20 mL，冷卻過夜12 h，4000 r/min離心20 min，棄上清液，加80%乙醇溶液至20 mL洗滌除去單糖影響，4000 r/min離心10 min，棄上清液，水浴揮干乙醇，加水定容至40 mL，即得。

1.4.4 樣品多糖含量測量 用移液槍精密移取0.5 mL樣品溶液置于試管(50 mL具塞試管)中，精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，加入硫酸5 mL，依上述方法測定吸光度，計算得粗多糖含量。

1.4.5 方法學考察 (1)重復性試驗精取5份某一樣品配制溶液取0.5 mL，按1.4.2操作，測定吸光度，計算吸收波長的相對標準偏差(RSD)，考察其精密度。

(2)穩定性試驗精取某一樣品溶液0.5 mL，按1.4.2操作，分別在0、1、2、3、4 h測定吸光度，計算吸收波長的相對標準偏差(RSD)，考察其穩定性。

(3)精密度試驗精取某一樣品溶液0.5 mL,按1.4.2操作，重復5次測量吸光度，計算吸收波長的相對標準偏差(RSD)，考察其精密度。

1.5 數據預處理及建立預測模型

運用UV-2550雙通道紫外可見分光光度計自帶的UVprobe工作站選擇數據，在Excel 2003軟件中做出標準曲線：y=0.0079x+0.027，R2=0.9995；利用回歸方程結合樣品吸光度計算樣品中總多糖含量，進行方法學考察。使用OMNIC軟件對紅外光譜數據進行基線校正，縱坐標歸一化等預處理。導入SIMCA-P+11.5軟件進行Savitsky-Golay平滑(SG)、一階導數(First Derivation，1D)、二階導數(Second Derivative，2D)、標準正態變量校正(Standard Normal Variable，SNV)、多元散射校正(Multiplicative Signal Correction，MSC)、正交信號校正(Orthogonal Signal Correction，OSC)等組合處理，進行偏最小二乘回歸建模。

2 結果與分析

2.1 樣品紅外光譜分析

根據1.3中的試驗方法，掃描樣品的傅里葉紅外光譜，從圖1可以看出：1～12月，鐵皮石斛在不同采收月份的原始圖譜特征峰相似，采收的鐵皮石斛的峰位置一致，峰高存在差異，意味著化學成分一致，但含量有所不同。其中3400 cm-1附近主要為O-H伸縮振動；2924 cm-1附近主要為烷烴C-H的伸縮振動；1800～1500 cm-1波段主要包括C=C、C=O、C=N等伸縮振動以及苯環的碳骨架環內振動；1500～1300 cm-1波段信息主要代表了C-H的彎曲振動；1300～910 cm-1波段是單鍵的伸縮震動區以及部分含氫基團的彎曲振動；910 cm-1以下波段主要包括苯環面外彎曲振動與環彎曲振動，烯的碳氫彎曲振動等。紅外光譜記錄了樣品中多糖類化合物O-H、C=O、C=C、苯環等多種鍵位的化學信息，這為利用紅外光譜對鐵皮石斛中總多糖進行快速預測提供了理論基礎[11,22]。

圖1 鐵皮石斛樣品的紅外光譜

2.2 多糖含量計算

按1.4條件下采集鐵皮石斛樣品、樣品+葡萄糖、葡萄糖的紫外光譜，比對可以發現，3者在488 nm附近有共有吸收峰，且樣品中加入葡萄糖后吸收光度變化明顯。因此，本試驗采用488 nm為總多糖定量波長。葡萄糖標準品吸光度與濃度的回歸方程為y=0.0079x+0.027，相關系數R2=0.9995，線性關系良好。方法學考察精密度、重現性和穩定性，結果表明，RSD分別為0.2%、0.31%和1.3%，表明該方法穩定、可靠。采集樣品紫外光譜，記錄488 nm處吸光度值，結合葡萄糖標準品回歸方程計算12個月份鐵皮石斛中總多糖含量見表1。結果顯示所有樣品中，1～5月和12月樣品含量較高，平均含量均大于0.28 g/g，含量值高的月份正好與傳統采收期吻合，這與李彩霞等[23]對鐵皮石斛中多糖含量的積累研究結論相符。5月份以后多糖含量逐漸下降，可能是因為鐵皮石斛屬于有性繁殖，其開花結實過程消耗了多糖[24]，筆者從前期所做工作中推測可能存在多糖消耗轉化為黃酮的代謝途徑。總多糖含量變化趨勢為先升高后降低；同時，5月份多糖含量的標準差數值最大，亦表示此時期為鐵皮石斛生長周期中的劇烈時期，個體差異最大；6～8月含量最低。與鐵皮石斛開花結籽時間相符。

2.3 偏最小二乘回歸對總多糖含量預測與結果分析

預處理鐵皮石斛紅外光譜數據設為X變量，總多糖含量數據設為Y變量，利用偏最小二乘回歸算法建立總多糖含量的回歸預測模型。隨機選取訓練集∶預測集=2∶1訓練集數據用于總多糖含量預測模型的建立，預測集數據對模型預測能力進行驗證。

在預處理的基礎上，對光譜數據進行一階與二階導數處理，Savitsky-Golay平滑5點(SG5)、9點(SG9)、15點(SG15)。紅外光譜數據作為X變量，鐵皮石斛中總粗多糖含量作為Y變量，正交信號校正(OSC)去除X變量中與Y變量相關性較低的數據，SG平滑可以有效平滑高頻噪音，提高信噪比；一階導數和二階導數分別用于消除光譜中基線的平移和漂移(散射)可有效消除其他背景的干擾，分辨重疊峰提高分辨率和靈敏度；SNV和MSC用于消除由樣品顆粒分布不均勻、顆粒大小不同產生的散射對其光譜的影響[11,25-26]。不同處理模型，訓練集模型內部預測能力以參數Rcal2、RMSEE衡量，Rcal2越接近1，RMSEE越小表示模型擬合能力越佳。預測集數據用于對模型預測能力進行外部驗證，以參數Rpre2、預測均方根誤差(Root mean square error of prediction,RMSEP)衡量，Rpre2越接近1，RMSEP越小表示模型預測效果越佳；15種模型結果見表2。結果顯示，15種模型中2D+OSC+MSC+SNV+SG5(圖3)模型預測效果較好，RMSEP均小于3.6，預測值與檢測值接近。

表1 鐵皮石斛1～12月總多糖含量

表2 不同模型的參數和結果

圖2 2D+OSC+MSC+SNV+SG5-PLSR模型的訓練集擬合結果

圖3 2D+OSC+MSC+SNV+SG5-PLSR模型的預測集擬合結果

3 結論

傅里葉變換紅外光譜結合化學計量學能快速預測鐵皮石斛中總多糖，為市售鐵皮石斛質量控制提供了一種快速方法。樣品原始光譜經自動基線校正、平滑、縱坐標歸一化后用2D+OSC+MSC+SNV+SG5建立的偏最小二乘模型的Rpre2大于0.782，RMSEP小于3.56能夠較好地預測鐵皮石斛中總多糖的含量?？偠嗵菧y量值反映總多糖含量隨時間的累積先上升后降低，最高值與鐵皮石斛采收時間相吻合。從圖2和圖3中可以看出：偏離的擬合曲線方程的38、40、41號樣品分別隸屬4和5月份，排除人為和儀器誤差外，測量值偏離預測值，表示該月份樣品差異較大，生長波動激烈，從側面表現了該組樣品的標準差較大。由于試驗材料的限制，僅采集了云南省玉溪市的鐵皮石斛樣品，不同生長環境條件下鐵皮石斛中總多糖的變化趨勢是否能與之相同有待進一步驗證。

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