應用RACE法克隆雷竹筍PAL基因及序列分析

張規富,汪 浩

(湖北科技學院 核技術與化學生物學院，湖北 咸寧 437100)

雷竹(Phyllostachyspraecoxf.prevernalis)屬禾本科剛竹屬,原產于浙江臨安一帶；鮮雷竹筍富含營養成分,是頗受歡迎的綠色保健食品[1]。雷竹筍被挖取后驟然離體,體內會產生一系列的生理生化變化,導致迅速老化而喪失鮮嫩可口的食用品質,主要表現為纖維素和木質素含量增加,使筍體變硬,含水量降低,營養成分減少[2]。這種木質化過程是在一系列酶促反應下進行的,其中苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine Ammonia-Lyase, PAL;EC4.3.1.5)起著重要的作用；PAL是苯丙烷途徑的限速酶,它的活性與木質素芳香醇的產量密切相關,直接影響木質素的合成[3]。

目前,一些研究者已對擬南芥[4]、煙草[5]、番茄[6]、葡萄[7]、銀杏[8]、香蕉[9]、毛竹[10]、桂花[11]、夏枯草[12]等多種植物的PAL基因進行了cDNA克隆、序列分析以及蛋白質的功能研究,但有關雷竹筍PAL基因的研究尚未見報道。本研究采用RT-PCR及RACE方法克隆了鮮雷竹筍的PAL基因并對其進行了生物信息學分析,旨在為采后雷竹筍的保鮮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

雷竹筍由湖北瑞發生物工程股份有限公司提供。去除筍葉，先用流水沖洗,后用雙蒸水沖洗4～5 min,在75%乙醇中浸泡30 s,取出用雙蒸水沖洗4次,將筍體表面殘存的水分用滅菌濾紙吸干后置于液氮中快速冷卻,放置于-80 ℃冰箱中備用。菌株為實驗室自備。pMD?18-T Simple Vectorkit購自美國Invitrogen公司。多糖多酚類植物RNA提取試劑盒、Version 2.0 5′ RACE試劑盒、SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit User Mannual試劑盒、膠回收試劑盒均購自武漢泰晟生物有限公司。引物合成及序列測定由武漢轉導生物實驗室和上海生工公司完成。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計 參照NCBI上已發表的禾本科PAL基因家族的保守區序列,采用簡并引物設計方法設計PCR引物。根據引物試劑盒及擴增序列的要求,利用Prime 5.0軟件設計RACE引物(表1)。上述引物均由武漢轉導生物實驗室合成。

表1 設計的PCR引物

1.2.2 總RNA的提取 鮮雷竹筍的總RNA的提取參照楊衛東等[13]的方法。用無菌DEPC水溶解提取的總RNA,RNA的完整性用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,通過OD260/OD280來確定RNA的純度,于-80 ℃的冰箱中保存備用。

1.2.3 中間片段的釣取 以雷竹筍近緣物種的保守序列設計引物PALF4、PALR4,然后進行擴增，釣取中間片段。

1.2.4PAL基因的5′RACE 5′RACEPAL基因的5′端序列采用Invitrogen公司的Version 2.0 5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends試劑盒獲得。對雷竹筍總RNA進行PAL基因第一鏈cDNA的合成使用Superscript II RT酶和引物GSP-1。對合成的cDNA進行去RNA處理使用RNase Mix。對經RNase處理過的cDNA進行純化使用DNA純化系統GLASSMAX DNA isolation spin cartridges。對純化后的cDNA末端加上多聚C使用dCTP和TdT酶。對已經加dC尾的cDNA進行PCR第一輪擴增使用試劑盒里面帶的橋連鉚釘引物AAP和引物GSP-2,擴增程序為:預變性94 ℃ 1～2 min，變性94 ℃ 0.5～1 min，引物退火55 ℃ 0.5～1 min，引物延伸72 ℃ 1～2 min,共30～35個循環;72 ℃最后延伸5～7 min,5 ℃擱置,直到樣品被移出。稀釋5 μL第1輪PCR擴增產物到495 μL TE緩沖液中，巢式PCR第二輪擴增使用試劑盒里面的橋連通用擴增引物AUAP和引物GSP-3,擴增程序為:預變性94 ℃ 2 min，變性94 ℃ 45 s,引物退火55 ℃ 45 s,引物延伸72 ℃ 1 min,共35個循環;72 ℃延伸5 min。第二輪PCR產物電泳后,切膠回收純化目的條帶。將純化后的PCR產物與pMD18T連接,送上海生工公司，對轉化后的陽性克隆進行測序。

1.2.5PAL基因的3′RACE 3′RACEPAL基因的3′端序列采用Clontech公司的SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒獲得。對雷竹筍總RNA進行逆轉錄合成cDNA使用引物3′CDS primer A和逆轉錄酶SMARTScribeTMReverse Transcriptase。以該cDNA為模板,使用引物3′905-1和UPM(Universal Primer A Mix)進行第一輪PCR擴增,擴增程序與1.2.4第一輪相同。稀釋第一輪PCR擴增產物50倍,用引物UPM和3′905-2進行第二輪擴增,擴增程序與1.2.4第二輪相同。將第二輪PCR產物進行電泳,切膠回收純化目的條帶。將純化后的PCR產物送上海生工測序。

1.2.6PAL基因的全長拼接及序列分析 對5′RACE和3′RACE序列測序結果使用DNAman軟件進行拼接,全長序列理化分析使用DNAstar軟件,PAL基因核苷酸及其編碼的氨基酸同源性分析、氨基酸進化樹的構建使用MegAlign軟件。

2 結果與分析

2.1 雷竹筍總RNA的提取

用多糖多酚類植物RNA提取試劑盒抽提鮮雷竹筍的總RNA,所提取總RNA的質量用紫外分光光度計進行檢測,OD260/OD280=2.07,表明所提取的總RNA的質量達標;對所提取的RNA用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,可見兩條清晰的條帶,無明顯拖帶(圖1),表明該總RNA無降解,可用于后續研究。

圖1 雷竹筍RNA的電泳鑒定結果

2.2 雷竹筍PAL基因中間片段的釣取

以設計的引物PALF4、PALR4擴增釣取雷竹筍PAL基因的中間片段,產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析,得到1條長603 bp的特異性擴增條帶(圖2),其中有效的中間片段長503 bp。

1:中間片段PCR產物; M: Marker相對分子質量標準。

2.3 雷竹筍PAL基因的5′RACE

用從筍尖組織提取的總RNA為模板,經過兩輪PCR擴增,采用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行分析,檢測到1條特異擴增條帶,大小為250～500 bp(圖3)。將純化后的PCR產物與pMD18T連接,對轉化后的陽性克隆進行測序,大小為463 bp；5′RACE末端附近由于加接頭的實驗特殊性,導致100多個堿基可能不準確,正確的編碼區序列長305 bp。

1：5′PAL基因PCR產物; M： Marker相對分子質量標準。

2.4 雷竹筍PAL基因的3′RACE

對雷竹筍總RNA進行逆轉錄合成的cDNA,經過兩輪PCR擴增,產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析,檢測到1條特異擴增條帶,大小為1000～2000 bp(圖4)。將純化后的PCR產物送至上海生工公司直接測序,得到堿基序列含1445 bp,拼接時有效的堿基序列含1397 bp。

2.5 雷竹筍PAL基因的序列分析

雷竹筍PAL基因5′RACE、中間片段和3′RACE堿基序列通過DNAman軟件拼接,得到2511 bp的全長cDNA序列,核苷酸序列的94～2196 bp區域為開放閱讀框,總長2103 bp。PAL基因共編碼701個氨基酸的多肽(圖5)。

1：3′PAL基因PCR產物; M：Marker相對分子質量標準。

從圖5可以看出,在701個氨基酸中,強酸性氨基酸(D,E)78個,強堿性氨基酸(K,R)73個,疏水性氨基酸(A,I,L,F,W,V,M,P)310個,極性氨基酸(G,S,Y,C,T,N,Q,K,R,H,D,E)391個。總體上,PAL蛋白中極性氨基酸的數目較多,可以推斷,PAL蛋白屬于親水性蛋白。

使用DNAStar軟件進行分析,PAL基因序列分析結果見表2。從表2可知,預測PAL蛋白分子質量為75.624 kD,預測蛋白質等電點為6.41。在2103個堿基中:A占14.58%,C占29.39%,G占36.47%,T占19.56%,(A+T)占34.14%,(C+G)占65.86%。

表2 雷竹筍PAL基因序列分析結果

2.6 雷竹PAL蛋白二級結構分析

采用SOPMA工具分析二級結構在雷竹PAL蛋白中的比例,結果如表3所示。由表3可以看出,雷竹PAL蛋白的二級結構具有豐富的α螺旋和螺旋卷曲,而β折疊片層結構和β轉角結構所占比例較低。

表3 PAL蛋白二級結構所占比例

2.7 雷竹PAL蛋白質三級結構預測

利用SWISS-MODEL同源建模的方法分析和預測得到PAL蛋白的三維結構模型(圖6)。從圖6可見：雷竹PAL蛋白三維結構模型的模板為1w27.1.A,兩者序列的同一性達到70.75%,說明兩者的三維結構基本相同；GMQE值(全球性模型質量估測值)為0.85,說明建模質量較好；QMEAN4為2.95，小于4,說明綜合計分的質量估計較好；PAL蛋白的三維結構模型為一個帶柄的圓錐形。

圖5 雷竹PAL基因編碼區核酸序列和由此推導的氨基酸序列

2.8 雷竹PAL基因核苷酸序列比較與系統進化樹分析

使用MEGA 5.03軟件將雷竹PAL基因的核苷酸序列與NCBI中31種已經發表的植物核苷酸序列進行距離和系統進化分析，結果(圖7)顯示：雷竹PAL與禾本科竹亞科植物毛竹(Phyllostachysedulis)、綠竹(Bambusaoldhamii)的親緣關系最近;與禾本科植物小麥(Triticumaestivum)、大麥(Hordeumvulgare)、水稻(Oryzasativa)、佛肚竹(Bambusaventricosa)的親緣關系較近;與玉米(Zeamays)、高粱(Sorghumbicolor)的親緣關系較遠。

左圖中紅色部分為α螺旋；黃色部分為β折疊片；藍色和綠色部分為螺旋卷曲。

圖7 雷竹PAL基因核苷酸序列的進化樹分析結果

3 討論

在高等植物中PAL基因廣泛存在,是木質素合成的關鍵酶和限速酶[14]。PAL基因的編碼區長度變化不大,一般在2100 bp左右[15]。本研究從鮮雷竹筍中分離得到的PAL基因所含的cDNA的開放閱讀框長度為2103 bp,編碼701個氨基酸；而與雷竹筍同科的高節竹、龍鱗竹、白哺雞竹、麗水苦竹這4種竹種PAL基因的編碼區長均為2136 bp,編碼712個氨基酸[16]。說明即使是同科的植物種類,PAL基因也可能存在個性差異。大多數植物PAL基因唯一的內含子位置是保守的,且長度變化很大[15]。5種竹子均具有一個保守的PAL活性位點Ala-Ser-Gly(A-S-G)(圖5中雷竹氨基酸序列549-550-551),說明同科植物PAL基因的內含子長度變化甚微。PAL基因的表達在植物中具有組織特異性,且不同家族成員的同一物種PAL基因的表達也不同[10],因此,PAL同源基因在雷竹筍中是否存在還有待應用Southern雜交等方法進行進一步分析。本研究已完成了PAL蛋白二級結構分析以及三級結構的預測,下一步計劃通過改變PAL蛋白的結構來探討PAL基因對雷竹筍生理生化的影響,從而進一步構建RNA干擾表達載體轉至雷竹筍中,探究PAL基因在雷竹木質素合成過程中的作用機制。

4 小結

本研究成功地從鮮雷竹筍中分離得到了一個全長PAL基因,其開放閱讀框長度為2103 bp,共編碼701個氨基酸,含1個保守的活性位點Ala-Ser-Gly(A-S-G)；預測PAL蛋白質分子質量為75.624 kD,等電點為6.41；在2103個堿基中，A占14.58%,C占29.39%,G占36.47%,T占19.56%,(A+T)占34.14%,(C+G)占65.86%；在PAL蛋白的二級結構中含有大量的α螺旋和β折疊；其三級結構模型為一個帶柄的圓錐形。

[1] 張規富,張玲玲,杜六甫.雷竹筍營養成分的分析測定[J].安徽農業科學,2008(3):841-842.

[2] 王敬文.采后竹筍老化生理研究[J].林業科學研究,2002(6):687-692.

[3] 何聰芬,劉蕾,董銀卯,等.竹子木質素合成酶基因克隆與分析[J].西北植物學報,2011(2):273-279.

[4] Ohl S, Hedrick S A, Chory J, et al. Functional properties of a phenylalanine ammonia lyase promoter fromArabidopsis[J]. Plant Cell, 1990, 2(9): 837-848.

[5] Yamakado M, Kawai S, Katayam Y, et al. Cloning and analysis of genomic sequences amplified enzymatically for phenylalanine anlmonia-lyase from poplar and tobacco [J]. Journal of the Japan Wood Research Society, 1991, 37(8): 761-765.

[6] Yeo Y S, Lee S W, Kim Y H, et al. Restriction mapping of phenylalanine ammonia-lyase gene family in tomato (Lycopenwonesculentum) [J]. RDA Journal of Agricultural Science Biotechnology, 1994, 36(2): 187-192.

[7] Sparvoli F, Martin C, Scienza A, et al. Cloning and molecular analysis of structural genes involved in flavonoid and stilbene biosynthesis in grape (VitisviniferaL.) [J]. Plant Molecular Biology, 1994, 24(5): 743-755.

[8] 程水源,杜何為,許鋒,等.銀杏苯丙氨酸解氨酶基因的克隆和序列分析[J].林業科學研究,2005,18(5):573-577.

[9] Wang W, Hu Y L, Xie J H. Cloning, expression and activation analysis of phenylalanine am monia-lyase gene from banana (Musaspp. AAA, Williams Mutant) [J]. Acta Laser Biology Sinica, 2009, 18(3): 67-72.

[10] 高志民,彭鎮華,李雪平,等.毛竹苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及組織特異性表達分析[J].林業科學研究,2009,22(3):449-453.

[11] 張威威,許鋒,張芙蓉,等.桂花苯丙氨酸解氨酶基因的克隆與序列分析[J].華北農學報,2010,25(5):56-60.

[12] 許鋒,曹騰,寧迎晶,等.夏枯草苯丙氨酸解氨酶基因的克隆與表達分析[J].華北農學報,2012,27(1):39-44.

[13] 楊衛東,王敬文,張金萍,等.孝順竹RNA提取方法研究[J].林業科學研究,2005,18(6):769-772.

[14] 魏麟,伍賢進,劉勝貴,等.魚腥草查耳酮合成酶1基因cDNA克隆、差異表達及其蛋白質序列分析[J].中草藥,2013,23:3372-3378.

[15] 趙志常,高愛平,陳業淵,等.芒果PAL基因的克隆與序列分析[J].安徽農業大學學報,2015,42(5):825-830.

[16] 李潞濱,劉蕾,張淑萍,等.4種竹子木質素合成酶PAL的基因克隆和序列分析[J].科技導報,2009,22:19-25.