全煙氣暴露試驗技術(shù)進展

韓亞偉，張東鵬，黃麗萍，陳利平

（鄭州輕工業(yè)學院煙草行業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，河南鄭州 450002）

為了分析吸煙與某些疾病的聯(lián)系，需要了解卷煙抽吸過程中發(fā)生的各種物理化學變化及抽煙過程中的復雜動態(tài)，以便確定一些與抽煙不利于健康有關的前兆和機制。近幾十年來，隨著理化分析技術(shù)的研究和發(fā)展，主流煙氣中的大部分成分已經(jīng)得到確定。煙氣是一種復雜的、動態(tài)的氣溶膠，包含了數(shù)以千計的化學成分，最新的研究數(shù)據(jù)顯示，其中含有5 600余種化學成分，約158種物質(zhì)具有毒理學效應，學術(shù)上稱之為煙氣毒物[1]。這些成分會導致某些疾病。例如，與慢性阻塞性肺病和肺中毒有關的醛類（甲醛、丙烯醛、乙醛）在卷煙煙氣氣相中多有存在；多環(huán)芳烴類（PAHs）、煙草特有亞硝胺類（TSNAs）、砷、鎘和鉻在卷煙煙氣中均有發(fā)現(xiàn)，這些物質(zhì)與多種癌癥的發(fā)生有關。

1 全煙氣暴露試驗技術(shù)概述

以往的卷煙煙氣毒理學研究方法比較側(cè)重于用劍橋濾片捕獲顆粒相，然后用DMSO溶解洗脫，或者直接以氣泡的形式充入細胞培養(yǎng)基或PBS中，隨后進行細胞培養(yǎng)，這樣就相當于細胞在煙氣顆粒相中進行暴露培養(yǎng)。不足的是，以顆粒相為主的暴露培養(yǎng)方案沒有考慮到卷煙煙氣的氣相物質(zhì)，以及顆粒相和氣相之間的相互作用。浸入式的培養(yǎng)條件和基于煙氣顆粒相的暴露，并不能完全從生理上模擬人類肺細胞在主流煙氣下的暴露條件。此外，以這種方式分離的煙氣可能會發(fā)生轉(zhuǎn)化和化學變化，并不能充分代表全部煙氣氣溶膠的性質(zhì)。為了盡可能模擬人類肺細胞在主流煙氣下的暴露反應，研究人員發(fā)明了一種細胞全煙氣暴露系統(tǒng)。目前，雖然全煙氣暴露系統(tǒng)在技術(shù)上存在很多困難，但是它能收集煙氣中的顆粒相和氣相，能較為綜合地反映煙氣性質(zhì)，是一種更加精確的生物學檢測系統(tǒng)，代表著卷煙煙氣生物學分析技術(shù)的發(fā)展方向[2]。全煙氣暴露下，捕獲的粒相與氣相在一起充分反應，這種系統(tǒng)的另外一個優(yōu)點是不同的細胞培養(yǎng)物可以在空氣-液體界面條件下充分與全煙氣接觸，能夠更好地模擬人體細胞在抽煙時的暴露環(huán)境。

目前，已經(jīng)有各種各樣的全煙氣暴露系統(tǒng)，有已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)的，也有一些公司自行研制、開發(fā)、升級，僅供公司內(nèi)部研究使用的。不管它們的類型，這些系統(tǒng)一般都有2個主要組成部分：①吸煙機，用于產(chǎn)生、稀釋和輸送煙氣；②暴露室，通常是一個存在空氣-液體界面的密閉空間，用來模擬人體環(huán)境，不同系統(tǒng)的設置參數(shù)不同，輸入煙氣量的大小也可以用多種方式表示。

2 全煙氣暴露系統(tǒng)研究進展

傳統(tǒng)的煙氣暴露分析技術(shù)主要是基于收集卷煙煙氣顆粒相，而忽略了氣相和半揮發(fā)物質(zhì)，這推動了全煙氣暴露系統(tǒng)的發(fā)展。全煙氣暴露系統(tǒng)還有一個優(yōu)勢，就是可以通過試驗參數(shù)的設置，對卷煙煙氣的各相進行統(tǒng)一或者獨立的分析。這使研究人員可以像定制衣服一樣，根據(jù)試驗目的設置試驗參數(shù)，有針對性地檢測分析煙氣各相，得到有用的信息。目前有各種各樣的全煙氣系統(tǒng)可以選擇，其中大部分系統(tǒng)既可以向培養(yǎng)的細胞輸送單一氣溶膠，也可以輸送復雜的氣溶膠混合物，因此，這些系統(tǒng)可以應用于煙草以外的行業(yè)，但目前為止，關于煙氣中化學成分檢測分析技術(shù)的論文信息比較有限[3]。市場上可以購買的吸煙機型號有Borgwaldt RM20S，Burghart MSB-01和vitrocellR VC 10等。市售的暴露間或暴露模塊與吸煙機相連接組成全煙氣暴露系統(tǒng)，主要的系統(tǒng)類型有英美煙草公司研發(fā)的系統(tǒng)、漢諾威cultex實驗室研發(fā)的系統(tǒng)和瓦爾德基希vitrocell實驗室研發(fā)的系統(tǒng)。由于最初同屬于一個研發(fā)團隊，系統(tǒng)和系統(tǒng)的曝光模塊之間有一些明顯的相似之處，這個團隊一直致力于全煙氣體外毒理學檢測技術(shù)的改進，經(jīng)過7年（1999—2006） 在科學、技術(shù)和商業(yè)化運作上的合作與發(fā)展，此團隊逐步壯大，最終一分為二，形成了今天的團隊和團隊。這也是為什么系統(tǒng)和系統(tǒng)之間有這么多的相似性和較好的相容性，也解釋了近期發(fā)展中的多樣性。

2.1 定制系統(tǒng)

定制的暴露系統(tǒng)常被用于卷煙煙氣理化分析的基礎性研究。雖然商用型號和定制系統(tǒng)之間沒有太多可比之處，但這些根據(jù)目的而設計制作的獨一無二的暴露裝置成本低，占地面積不大，構(gòu)造不那么復雜，并且更易于維護。舉幾個例子探討如何使用定制的暴露系統(tǒng)得到有實際意義的生物學試驗數(shù)據(jù)。

Scian M J等人[4]描述了一個具有空氣-液體（ALI）界面的暴露系統(tǒng)，研究了2種香煙的混合主流煙氣對大鼠支氣管上皮細胞的影響。該暴露系統(tǒng)包括1個具有2個通風孔的“密封室”，其大小足以容納一個細胞培養(yǎng)板，并安裝有一個小風扇。細胞培養(yǎng)3 d，每天進行2次煙氣暴露，分別在第1天和第3天收獲部分細胞培養(yǎng)液，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測MCP-1，IL-10，VEGF這3種蛋白的分泌量[4]。此外，圣勞倫特還進行了一個對比試驗，將細胞置于融有卷煙煙氣提取物（CSE） 的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，將2項試驗結(jié)果進行對比。結(jié)果表明，相對于CSE模型試驗，細胞全煙氣暴露過程中MCP-1蛋白的分泌被抑制，產(chǎn)生的IL-10蛋白減少，VEGF的分泌量基本相同。圣勞倫特指出，在CSE和ALI這2種暴露培養(yǎng)模式下，小鼠支氣管上皮細胞蛋白質(zhì)分泌量的不同，表明選擇何種試驗模型對所獲得的數(shù)據(jù)有一定影響。此外，在使用不同卷煙煙氣組分時，會有不同的細胞反應，這也表明不同的煙氣組分在組織反應中具有獨立的作用。

另一個例子中，菲利普斯等人將暴露室與一個簡單的室內(nèi)煙氣發(fā)生器相連接，用以評估煙氣對人支氣管上皮細胞和卡他莫拉菌感染的天然免疫反應的影響。用泵將一支煙吸盡，將煙氣抽入一只1 000 mL的燒瓶中，對細胞進行10 min的ALI暴露。結(jié)果表明，煙氣增加了細菌數(shù)量，但抑制了前列腺素E2（PGE2） 的產(chǎn)生，PGE2已被證明具有免疫調(diào)節(jié)功能。菲利普斯指出，該試驗結(jié)果有助于闡明PGE2在阻塞性肺氣腫（COPD）患者的黏膜天然免疫反應中的作用。

在最后一個例子中，瓜萊爾齊等人用管子將一支香煙、一個注射器和一個無菌瓶連接起來，形成一個T形結(jié)構(gòu)，結(jié)合處由一個閥門連接，從而制作出一個簡單但獨特的裝置。無菌瓶中含有取自不抽煙的健康女人的角質(zhì)化口腔黏膜細胞，處于半浸沒條件，從而更好地模擬口腔生理環(huán)境[5]。在6 min內(nèi)，用注射器抽入煙氣，打開閥門，將煙氣注入無菌瓶，然后取下無菌瓶，讓煙氣流出，使空氣再循環(huán)，重復操作直到香煙抽盡。暴露后，利用組織化學和免疫熒光技術(shù)分析細胞間黏附的生物標志物。結(jié)果表明，對煙氣的反應是從口腔上皮的基底層和基底上層開始的，在煙氣暴露后3 h即出現(xiàn)了K14蛋白的高豐度表達。此外，這種裝置模擬了口腔黏膜的三維特性，而且能夠模擬吸氣、呼氣循環(huán)。

2.2 Borgwaldt系統(tǒng)

Borgwaldt RM20S是一種旋轉(zhuǎn)式、注射器式機械吸煙機，能夠同時抽吸8支香煙而且不會發(fā)生交叉污染。這種獨立抽煙的設計8種不同的卷煙煙氣稀釋成同一濃度或?qū)⒁环N卷煙煙氣稀釋成8種濃度。因此，RM20S型吸煙機既可以用于煙草制品評價，還可以用于基礎研究。首先，吸嘴吸一口煙氣，然后充入過濾空氣，達到稀釋的目的，通常以煙氣與空氣的體積比率來反映稀釋程度，高稀釋度需要一個連續(xù)稀釋的過程。將稀釋過的煙氣以0.8 L/min充入暴露室。每個吸嘴對應一個獨立的暴露室，從而防止發(fā)生交叉污染。

盡管不是由同一公司生產(chǎn)，在設計上也不通用，但Borgwaldt RM20S型吸煙機幾乎和英美煙草公司（BAT）的暴露室完全匹配，這種暴露室由漢普郡工程技術(shù)有限責任公司生產(chǎn)。關于這二者的結(jié)合使用，已經(jīng)有一系列有關細胞體外研究進展和暴露系統(tǒng)性能的論文發(fā)表。菲利普斯等人率先使用RM20S型吸煙機和 BAT暴露室研究了支氣管上皮細胞NCIH292暴露于卷煙煙氣后的細胞反應。該項研究展示了細胞卷煙煙氣暴露之后的一系列反應，如細胞毒性、顆粒沉積、mRNA和蛋白的表達[6]。蒙德斯等人對人類肺支氣管上皮原代細胞進行煙氣暴露后，使用基因芯片技術(shù)，圍繞基因表達差異進行了更深入的研究。結(jié)果與先前體外、體內(nèi)研究中關于煙氣毒性的報道一致，如增加上皮細胞通透性、抗氧化反應和MAPK途徑的增加。蒙德斯等人指出，細胞黏附效應的下調(diào)反應，可能導致了細胞通透性增加，有可能與卷煙煙氣誘發(fā)性疾病有關。

對RM20S型吸煙機性能最早進行描述的是Kaur等人，他們對放在加拿大和英國2個位置的2臺機器進行了比較。通過使用碳氫化合物分析儀，10%甲烷氣體體積標準，對2個機器的稀釋精度進行了評估。結(jié)果表明，雖然注射體積難免有些變化，但這2臺機器的稀釋精度是相似的（小于10%的相對標準偏差）。亞當森等人對RM20S型吸煙機的性能進行了更進一步的描述，測定了RM20S系統(tǒng)在暴露過程中的煙氣的損失。賽安等人在系統(tǒng)的不同位置（抽煙后，暴露室前和暴露室后） 安裝了電遷移率光譜儀。結(jié)果表明，主流煙氣在細胞暴露室前約有48%的損失，在暴露室中約有16%的損失。

RM20S型吸煙機與BAT暴露室的組合的主要局限在于，迄今為止，它幾乎只被英美煙草公司使用，使得其研究結(jié)果很難與使用其他暴露系統(tǒng)所做的研究結(jié)果進行直接比較。

2.3 Burghart系統(tǒng)

Burghart公司的MSB-01型吸煙機與其他商業(yè)化的煙氣暴露系統(tǒng)有所不同，是一個多板層集成的系統(tǒng)，專為高通量的體外試驗而設計。暴露板（96孔板）集成于暴露系統(tǒng)，因而提供了一種簡單的暴露途徑，避免了將各個獨立的暴露模塊組合在一起的麻煩。MSB-01型吸煙機的吸嘴被設計成獨立的，這樣就可以同時對多種類型香煙或者同種香煙不同劑量進行實驗，稀釋能力可達1∶150（煙氣體積∶空氣體積，V∶V）。一個煙氣分流板通過2個孔道對細胞培養(yǎng)板進行持續(xù)暴露。從吸煙開始到細胞暴露于煙氣，大概需要6 s。

賽安等人對MSB-01型吸煙機的性能進行了測試，包括多孔板中的顆粒沉積、煙氣損失量、顆粒大小和細胞存活率。將曝光過程中沉積在培養(yǎng)板上的顆粒物溶解在DMSO中，用比色法測定量的大??；在系統(tǒng)各個位置捕獲顆粒相物質(zhì)，從而測定煙氣的損失量；對支氣管上皮細胞BEAS-2B進行煙氣暴露，從而測定細胞毒性。這些分析結(jié)果，有助于更好地了解MSB-01系統(tǒng)的性能表現(xiàn)[7]。此外，MSB-01系統(tǒng)對香煙煙氣的化學分析，有助于了解機器如何提供煙氣，以及稀釋度對顆粒物粒徑和分布的影響。賽安等人的研究結(jié)果表明，MSB-01系統(tǒng)的煙氣損失量與Borgwaldt RM20S系統(tǒng)相近，在40%～50%。

相比于其他煙氣暴露系統(tǒng)，MSB-01系統(tǒng)可以滿足高通量試驗的需求。然而，這種系統(tǒng)的一個潛在缺陷是，它不支持對細胞進行ALI暴露，這限制了MSB-01系統(tǒng)在初級細胞學研究中的應用。

2.4 Vitrocell系統(tǒng)

VitrocellRVC 10型吸煙機是一種旋轉(zhuǎn)式、單管道、連續(xù)稀釋性吸煙機，由德國Vitrocell公司生產(chǎn)。VC 10型吸煙機的注射器將卷煙主流煙氣輸送到獨立的連續(xù)流動稀釋模塊，它包含了4～5個稀釋閥門。過濾空氣垂直于煙氣氣流流動方向從稀釋閥門的上方和下方充入，與煙氣混合形成稀釋煙氣流，煙氣稀釋度通過增加或減小空氣氣流來實現(xiàn)。此外，由真空泵提供負壓，將稀釋過的煙氣從稀釋棒中吸到暴露模塊里。

VC 10型吸煙機通常與Vitrocell或Cultex暴露模塊聯(lián)合使用，因為這2個模塊的設計是互補的。暴露模塊直接安裝在連續(xù)流動稀釋系統(tǒng)下面，細胞培養(yǎng)板分別暴露于從稀釋棒抽出的稀釋煙氣中。此外，Vitrocell公司已經(jīng)開發(fā)了幾種暴露模塊來適配該系統(tǒng)。例如，用于細胞轉(zhuǎn)染試驗的3孔或4孔哺乳動物細胞暴露模塊，以及用于高通量暴露試驗的24孔和96孔培養(yǎng)板。此外，Vitrocell公司還研發(fā)了用于Ames試驗的細菌暴露模塊。所有的暴露模塊采用相同的“喇叭型”設計方案，這種設計思想與Cultex公司共享，將細胞直接暴露于煙氣氣溶膠中，使模塊內(nèi)具有更有效的擴散和沉積環(huán)境。

Okuwa等人使用VC 10系統(tǒng)，在多個吸煙條件下，將中國倉鼠肺細胞暴露于卷煙主流煙氣中，分析了細胞微核效應。此外，他們比較了全煙氣條件下與氣相條件下試驗結(jié)果的不同。有意思的是，Okuwa及其同事注意到，各個吸煙條件下，卷煙主流煙氣、顆粒相與氣相造成的微核效應是不同的，這表明，煙氣的各個部分都會對細胞微核效應產(chǎn)生影響。此外，他們使用光度計光散射技術(shù)作為一種實時測量工具進行半定量和監(jiān)測煙氣輸送，以確保試驗數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和可重復性。

和其他暴露系統(tǒng)一樣，VC 10系統(tǒng)有它自身的局限性。目前，有關VC 10系統(tǒng)的使用或介紹其性能的科學出版物比較少。此外，VC 10系統(tǒng)有很多參數(shù)可以設置，從而創(chuàng)建出所需的暴露模式。例如，稀釋空氣流（L/min） 和樣品流量（mL/min/板） 都可以獨立調(diào)節(jié)。然而，這種靈活性有可能是VC 10系統(tǒng)沒有得到大規(guī)模使用的原因，因為這些參數(shù)的設置操作還沒有充分完善。然而，這種情形在發(fā)生著變化，最近的一項研究使用這些參數(shù)來分析暴露模塊中的顆粒沉積量。有意思的是，增加樣品流量（mL/min）會使曝光模塊內(nèi)產(chǎn)生的顆粒沉積量減小。

2.5 CULTEX系統(tǒng)

位于德國漢諾威的CULTEX實驗室為空氣中的物質(zhì)的體外毒理學分析，如油氣、顆粒物、揮發(fā)性化合物和復雜氣體混合物，提供了空氣-液體界面（ALI） 暴露試驗的解決方案。CULTEX公司設計的體外暴露模塊可以應用于各種暴露系統(tǒng)，適用于多種暴露條件。因此，CULTEX系統(tǒng)在研究體外氣溶膠暴露和吸入毒理學中發(fā)揮了積極作用。

在過去的10年中，CULTEX暴露模塊被用于研究許多復雜的氣溶膠，如柴油機車廢氣、卷煙煙氣、藥理學研究、揮發(fā)性化合物、顆粒物和環(huán)境污染物。這些研究的多樣性表明了CULTEX暴露模塊的應用潛力。

在1999年和2000年，Aufderheide及其同事率先介紹了CULTEX暴露模塊的概念，在最初的2篇文獻中，概述了如何使用CULTEX系統(tǒng)對可吸入化合物（顆粒、礦物纖維和木屑）進行體外ALI暴露試驗。2001年，Ritter等人用CULTEX系統(tǒng)對合成的臭氧、二氧化氮進行了測試，以探索CULTEX暴露模塊內(nèi)部的暴露條件，說明該模塊可以為環(huán)境毒理學（空氣中的化學物質(zhì)）試驗提供多種研究方法。此外，Aufderheide等人對CULTEX模塊的性能做了進一步摸索，煙氣暴露之后，他們利用熒光分光光度計技術(shù)，檢測了顆粒沉積量、細胞活力和細胞谷胱甘肽表達水平。

CULTEX系統(tǒng)的最新進展是徑向流系統(tǒng)（RFS），可對培養(yǎng)基進出量進行精確控制。徑向排列的細胞培養(yǎng)孔均勻分布在中央進氣口周圍，使煙氣輸送更加均勻。RFS使用了“喇叭型”設計，使氣溶膠幾乎能直接輸送到細胞層。2011年，Aufderheide等人利用RFS系統(tǒng)，研究了人支氣管上皮細胞16HBE暴露于香煙煙氣后的細胞毒理學反應。此外，還利用RFS系統(tǒng)，以沙門氏菌株TA98和TA100為受試菌株進行Ames試驗，分析了暴露于卷煙煙氣后產(chǎn)生的回復突變菌落。Aufderheide等人最近的一個研究表明，RFS模塊中3個細胞培養(yǎng)孔流過的煙氣量是一致的，其中的一部分數(shù)據(jù)由計算流體動力學方法獲得，這個方法可以使研究人員更深入地了解暴露模塊中的煙氣流量情況。RFS模塊的培養(yǎng)孔呈徑向排列，這從根本上不同于呈線性對稱排列的其他暴露模塊，從而消除了線性采樣所造成的濃度差異。除了不同細胞培養(yǎng)孔煙氣流量一致，RFS模塊也可以同時培養(yǎng)3種不同的細胞，也可以進行Ames試驗。有意思的是，Aufderheide還分析了霧化納米氧化銅（CuO）顆粒的大小、分布與其沉積量之間的關系。例如，與細微顆粒相比，A549細胞直接暴露于納米氧化銅時，細胞毒性增加了。

對于多種暴露情況和氣溶膠化合物，CULTEX實驗室提供了多種暴露模塊。CULTEX實驗室還提供了沙塵氣溶膠發(fā)生系統(tǒng)，它由3個獨立的部件構(gòu)成：一個液壓機用于將各種粉末顆粒壓成粉餅，一個粉塵發(fā)生器用來提供均勻濃度的氣霧灰塵，一個綜合淘洗器用來貯存沙塵氣溶膠，這個綜合淘洗器像一個水庫一樣貯存著產(chǎn)生的顆粒物質(zhì)。