乳及乳制品中抗生素檢測方法研究進展

劉 碩，王勝潔，賈麗娜

（河北農業大學理工學院，河北滄州 061100）

牛奶營養豐富，可提高人體免疫力、增強體質，是對人類最有益、最健康的食品之一。隨著高速發展的乳及乳制品行業，其中廣泛應用了β-內酰胺類、氨基糖苷類、四環素類、大環內酯類等抗生素，雖然讓畜牧業達到了增產的效果，但也不可避免地造成了抗生素的殘留[1]。因此，為解決我國當前乳和乳制品行業面臨的難題而尋求簡便快捷、敏感性高的抗生素檢測方法已成為當務之急。

1 乳制品中抗生素殘留現狀

自2001年10月我國農業部發布的《無公害食品生鮮牛乳行業標準》中明確提出新鮮牛乳“抗生素不得檢出”的衛生指標。但對這一標準，我國并沒有嚴格執行，所以一直未能解決我國奶制品中抗生素殘留問題，致使人們開始擔憂牛奶的安全問題，并成為越來越受關注的熱點[2]。

2009年，劉維華等人[3]對寧夏的363批生乳進行檢測，檢測出β-內酰胺酶112批，總抗生素殘留145批，發現有非法添加、違反休藥期規定的抗生素超標現象。2012年，張萍等人[4]對鎮江地區市售包裝純牛奶及奶牛養殖場的生鮮牛奶進行隨機抽樣檢測，發現都有一定量的抗生素殘留。由此看來，我國乳業中還會長期存在牛奶中抗生素殘留的現象。

2 乳制品中抗生素來源

抗生素被廣泛地應用到奶牛養殖產業中，在對奶牛進行疾病治療和飼喂過程中很容易造成抗生素殘留，更因為一些人為因素，使抗生素直接殘留在牛奶中。乳制品中抗生素殘留的原因有：①抗生素常被當作治療藥物而用來預防和治療奶牛的各類疾病，經注射或者飼喂進入體內，通過血液進入乳房而殘留于牛奶中，尤其是治療牛乳腺炎時使用的灌注法，極易造成殘留；②為達到預防疾病并提高產量的目的，在奶牛飼料中加入抗生素，奶牛食用消化，可能進入各個組織器官，造成抗生素殘留；③不法商戶在擠奶、儲存運輸過程中的不規范操作，在高溫季節向牛奶中摻雜各種抗生素，以防止牛奶酸敗變質和細菌的生長繁殖，直接造成抗生素殘留。

3 乳制品中抗生素殘留危害

抗生素殘留于牛奶中會降低牛奶品質，還會給飲用的人們帶來身體上的危害，長期飲用則非常不利于人體健康，甚至會殘留在環境中污染環境。乳制品中抗生素殘留的危害有：①長期飲用含抗生素殘留的牛奶可使人體內某些致病菌產生耐藥性，造成菌群失調，患病后再使用同種藥物會降低治療效果，自然而然使人的免疫力下降；②在經常食用低劑量抗生素殘留食品的情況下，易感人群會出現超敏反應，短時間內出現喉頭水腫、呼吸困難、血壓下降等癥狀，嚴重者甚至休克[5]；③對體內敏感菌起到一定的抑制作用，但會導致體內細菌不敏感，在體內擴散，造成雙重感染，破壞腸道菌群平衡，從而破壞人體微生態平衡；④抗生素殘留的牛奶被人或動物食用后，未吸收的抗生素會從尿液和糞便中排出，留在環境中污染環境。

4 乳制品中抗生素殘留檢測方法

近年來，檢測技術發展迅猛，已經有大量簡便快捷且成本低、靈敏度高的檢測方法應用到乳制品抗生素殘留檢測中，如微生物檢測、理化檢測、免疫檢測等。未來更需要人們不斷探索研究出更加精確、簡便的檢測方法來滿足日趨嚴格的檢測要求。

4.1 微生物檢測法

微生物檢測法是經典的較為廣泛應用的方法，測定原理是根據抗生素對微生物生理機能、代謝的抑制作用來定性確定樣品中抗微生物藥物殘留[6]。它的測定時間長、結果誤差大、操作簡單、成本低，不需要大型儀器和專業操作人員完成，可在一般實驗室和農場使用。微生物檢測主要包括TTC法、試劑盒法等。

TTC法[氯化三苯基四氮唑（Tripheye tetrazolium chloride）]是我國鮮乳中抗生素殘留檢測的標準方法（GB 4789.27—2008） 第一法。其原理是利用 2,3,5氯化三苯四氮唑與指示菌反應顯色，當物質中有抗生素殘留顯色，無殘留則不顯色。然而，此法的檢測靈敏度還不夠高，而且時間較長，在3 h以上，但很適合奶牛場和食品衛生檢測部門使用。

黃怡君等人[7]采用TTC法對奶牛場常用的青霉素、紅霉素、卡那霉素、環丙沙星和磺胺嘧啶等幾種抗菌藥物檢測其最低檢測濃度，其結果為青霉素3 μg/kg，紅霉素 30 μg/kg，卡那霉素 6 200 μg/kg，環丙沙星500 μg/kg，磺胺嘧啶100 μg/kg。TTC 法應用范圍較廣，符合我國奶牛場中較多種類抗生素的使用現狀。

試劑盒法為牛奶中抗生素殘留的檢測提供了一種更方便、更有效的方法。其原理為：在65℃加熱微孔板，孢子萌發產酸，使培養基的pH值下降，顏色由紫色變為草綠色或黃色。如果牛奶中含有比檢測限高的抗生素，就抑制了孢子萌發，不產生酸，培養基保持原來的顏色。此方法用肉眼觀察顏色變化即可判斷抗生素殘留情況[8]。

謝莉等人[9]以嗜熱脂肪芽孢桿菌為指示菌，溴甲酚紫為指示劑，加入合適的營養基質作為輔助，研制了96孔板試劑盒法。對牛奶中青霉素、阿莫西林以及頭孢匹林的檢測限進行試驗，測出其檢測限分別為3，4，8 ng/mL。劉冬梅等人[10]也利用嗜熱脂肪芽孢桿菌對β-內酰胺類抗生素敏感的特點，優化其生長條件，制成試劑盒，測出青霉素鈉的檢測限為2～4 μg/L。試驗證明，此法靈敏度高于國標TTC法，而且省去了TTC法復雜的前處理，便宜快捷，適于推廣應用。

4.2 理化檢驗法

理化檢測方法是以抗生素分子性質為基礎，借助試驗儀器進行分離和檢測的一種方法。分離檢測應用的試驗技術包含色譜和電泳、紫外、熒光、質譜等。因為檢測靈敏、結果精確穩定，理化檢測法是一種精確檢測抗生素殘留的方法[11]。

王浩等人[12]采用液相色譜-串聯質譜方法對我國市售的50種乳品進行了檢測，檢出其中樣品氯霉素含量為0.48 μg/kg。這些樣品的檢測限不合格，違反了我國食品可食用組織不得檢出氯霉素的相關規定。張尹等人[13]結合超聲輔助萃取和固相柱萃取，優化了HPLC色譜分析條件，建立了完整的HPLC檢測牛奶中β-內酰胺抗生素殘留的分析方法。

這些方法具備定性和定量準確度較高等優點，但檢測儀器的費用較高、程序較復雜、有機溶劑的使用量很大，對人體和環境具有一定的危險性。

4.3 免疫分析法

酶聯免疫吸附法（ELISA）的特點有靈敏度高、特異性強、處理量大等優點。目前，應用最為廣泛，認可最高的是美國SNAP利用酶聯免疫和激光探測技術研發的SNAPTM抗生素殘留快速檢測系統，可以快速檢測出牛奶中的抗生素殘留量，但其影響因素較多，是國內外抗生素殘留比較普遍、快速的檢測方法[14]。

ELISA試劑主要對β-內酰胺類抗生素較敏感，對其他抗生素藥物的敏感度不高，何金環等人[15]用ELISA法對隨機抽取的50份純牛奶樣品進行抗生素殘留檢測，測出其抗生素陽性率為20%。姜侃等人[16]建立直接ELISA競爭法，檢測已知陰性和陽性的生鮮牛乳中的β-內酰胺類抗生素，優化了檢測條件，試驗結果準確，并未出現假陽性或者假陰性結果。ELISA測定法適于大量樣品檢測，可以推廣。

4.4 新檢測技術研究進展

免疫分析法具有影響因素多的缺點，理化檢測技術具有檢測程序復雜、檢測費用高等缺點，為克服上述缺點，將二者結合已經成為當今發展的一個趨勢。

表面等離子體共振（SPR）生物傳感器利用了免疫學的測定原理，可以進行多個樣品的快速檢測。劉瑾等人[17]在競爭法檢測的基礎上采用基于表面等離子體共振信號放大傳感器，對鏈霉素、卡那霉素的水溶液進行了殘留檢測試驗，最低檢測限分別由34 ng/mL和25 ng/mL降為24 ng/mL和12 ng/mL。結果表明，SPR生物傳感器在檢測牛奶抗生素殘留方面具有良好的應用前景。

蛋白質芯片（Protein chip）技術是將已知的蛋白分子產物固定在經特殊化學處理的固相載體上，根據生物分子特性，捕捉能與之特異性結合的待測蛋白，經洗滌、純化，再進行確認和生化分析。金娜等人以免疫競爭為原理，優化各項影響因素，快速、準確的檢測出呋喃唑酮代謝物（AOZ）的檢測限達到0.1 ng/mL。經試驗證明，蛋白質芯片技術可以有效進行抗生素檢測分析，適于推廣應用。

5 結語

從近15年來的檢測方法在牛奶抗生素殘留檢測中的研究進展及應用狀況來看，微生物檢測法不需要大型儀器和專業操作人員，簡便、快捷，適用于一般的乳制品廠、奶牛牧場、防疫站使用。免疫分析法雖然取樣量小，前處理簡單、處理量大，但其影響因素較多，使大部分技術仍然停留在實驗室水平。近年來，隨著試驗儀器的微型化、便捷化，將生物傳感器與蛋白芯片技術相結合，逐步應用到牛奶抗生素殘留的檢測中，或將是未來發展的必然趨勢。

參考文獻：

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[17]劉瑾，王文，張婉潔，等.基于表面等離子體共振傳感器信號放大的抗生素殘留檢測 [J].分析試驗室，2012，31 （11）：5-9.◇