發酵豆制品中蠟樣芽孢桿菌的調查分析

劉 琪，陳 靜，張佩娜，朱蔚姍，蔣立文

（食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南農業大學食品科學技術學院，湖南長沙 410128）

蠟樣芽孢桿菌是一種能在極端的環境條件下生存的革蘭氏陽性桿狀芽孢菌，大小為（1～1.3）×（3～5）μm，兼性需氧，芽孢不突出菌體，菌體兩端較平整，多數呈鏈狀排列，與炭疽桿菌相似[1]。它一般被認為是污染物，當數量達到一定級別也會引起重大疾病[2]。通常，當其在食物中的含量超過1×105CFU/g·mL時就有可能造成食物中毒[3]。蠟樣芽胞桿菌引起的食物中毒大多因食用剩飯、剩菜、乳制品等富含碳水化合物的食品[4]。芽胞具有耐熱性，短暫的熱處理會誘發芽胞的萌發，大量生長繁殖，產生毒素并引發食物中毒[5]。根據2008—2010年我國突發公共衛生事件報告管理信息系統統計，我國細菌性食物中毒事件中，由蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒在發生起數和發病人數方面均居前3位[6]。周彥伶等人在研究一起蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒中發現致病食品中蠟樣芽孢桿菌的菌落總數大于1×106CFU/g。而蠟樣芽孢桿菌在發酵豆制品中的安全隱患也已經引起了廣泛關注，其中尤以豆豉、腐乳[7]被研究較多。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

在超市中根據產品特點和區域加工差異性進行樣品的采集，以確保樣品的代表性。采集的樣品有3種類型，即豆豉、豆醬和腐乳。

樣品信息見表1。

1.1.2 試劑

甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂基礎（MYP）、營養瓊脂，廣東環凱微生物科技有限公司提供；50%卵黃乳液，青島高科技工業園海博生物技術有限公司提供；多黏菌素B（MYP及胰酪胨大豆多黏菌素B肉湯配套試劑），廣東環凱微生物科技有限公司提供。

蠟樣芽孢桿菌生化鑒定盒（葡萄糖（厭氧）、3%過氧化氫溶液、半固體瓊脂、硝酸鹽（還原）、溶菌酶營養肉湯、質控營養肉湯、甘露醇、葡萄糖磷酸鹽胨水（VP）、蛋白質毒素結晶體染色液），廣東環凱微生物科技有限公司提供。

1.1.3 主要儀器與設備

LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠產品；101-2AB型電熱鼓風干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司產品；LRH-250型智能生化培養箱，上海飛越實驗儀器有限公司產品；SW-CJ-1F型凈化工作臺，上海新苗醫療器械制造有限公司產品；ZWY-210型恒溫培養振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司產品。

表1 樣品信息

表2 蠟樣芽孢桿菌鑒定說明

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理方法

稱取每種樣品各25 g，分別放入225 mL裝有適當玻璃珠的無菌生理鹽水中，然后放入搖床中振搖30 min，再進行10倍系列稀釋，最后取2～3個適宜稀釋度進行接種培養。

1.2.2 蠟樣芽孢桿菌疑似菌的檢測

參照GB 4789.14—2014，每個稀釋度分別取0.3，0.3，0.4 mL接種到3個MYP瓊脂平板上，在30±1℃培養24～48 h，計數典型菌落數。

1.2.3 蠟樣芽孢桿菌的生化鑒定

對挑選出的蠟樣芽孢桿菌典型菌落進行純培養，并參照表2進行生化鑒定，再對照表3進行判定。

蠟樣芽孢桿菌鑒定說明見表2，蠟樣芽孢桿菌與其他類似菌的鑒別見表3。

1.3 數據處理

1.3.1 確認并計數典型菌落

選擇培養出了蠟樣芽孢桿菌典型菌落（粉紅色，周圍有粉紅色的暈）的平板，且同一稀釋度3個平板的菌落總數之和在20～200 CFU，計數典型菌落數。

1.3.2 計算公式

根據平板上不同的菌落數情況，選擇不同的計算公式。

表3 蠟樣芽孢桿菌與其他類似菌的鑒別

式中：T——樣品中蠟樣芽胞桿菌菌落數；

A——某一稀釋度蠟樣芽胞桿菌典型菌落總數；

B——鑒定結果為蠟樣芽胞桿菌的菌落數；

C——用于蠟樣芽胞桿菌鑒定的菌落數；

d——稀釋因子。

式中：T——樣品中蠟樣芽胞桿菌菌落數；

A1——第一稀釋度（低稀釋倍數）蠟樣芽胞桿菌典型菌落的總數；

A3——第二稀釋度（高稀釋倍數）蠟樣芽胞桿菌典型菌落的總數；

B1——第一稀釋度（低稀釋倍數）鑒定結果為蠟樣芽胞桿菌的菌落數；

B2——第二稀釋度（高稀釋倍數）鑒定結果為蠟樣芽胞桿菌的菌落數；

C1——第一稀釋度（低稀釋倍數）用于蠟樣芽胞桿菌鑒定的菌落數；

C2——第二稀釋度（高稀釋倍數）用于蠟樣芽胞桿菌鑒定的菌落數；

1.1 ——計算系數（如果第二稀釋度蠟樣芽胞桿菌鑒定結果為0，計算系數采用1）；

d——稀釋因子（第一稀釋度）。

1.3.3 數據統計

使用Excel 2010進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 樣品中蠟樣芽孢桿菌疑似菌檢測與分析

樣品中蠟樣芽孢桿菌疑似菌檢出情況見表4。

根據GB 4789.14—2014所確定的檢測標準，以甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂為培養基進行選擇培養，對采自市場上的13個發酵豆制品進行蠟樣芽孢桿菌疑似菌檢測，檢測結果如上表所示，不同種類、不同地區、不同生產工藝的發酵豆制品中蠟樣芽孢桿菌疑似菌普遍存在。幾類發酵豆制品中均檢出了蠟樣芽孢桿菌，總檢出率為84.6%，其中腐乳和豆豉樣品全部檢出，而豆醬只有一個樣品檢出。發酵豆制品是我國傳統的釀造產品，因其原料不同、產地不同、氣候條件存在差異，且參與發酵的微生物區系種類復雜等，產品的微生物控制難以達到標準化。腐乳生產工藝沒有殺菌處理過程，故成品受蠟樣芽孢桿菌及其他雜菌污染的幾率較高。豆豉后期有炒制過程，但仍均檢出了蠟樣芽孢桿菌，可能是炒制溫度不夠或者炒制時間不夠。豆醬盡管產品的含水量較高但一般產品保質期較長（長的有24個月），生產過程中進行了熬制和后期殺菌處理，微生物檢出率相對腐乳、豆豉要低，這種差異與產品加工工藝和產品品質差異有關。

表4 樣品中蠟樣芽孢桿菌疑似菌檢出情況

2.2 蠟樣芽孢桿菌的鑒定與數量分析

樣品中蠟樣芽孢桿菌數見表5。

表5 樣品中蠟樣芽孢桿菌數

我國發酵豆制品的相關標準中并沒有明確規定蠟樣芽孢桿菌的殘留限量，但香港地區食品中蠟樣芽孢桿菌可接受臨界值為1×105CFU/g·mL，因此我國大多是以此臨界值為參考，當攝入的食品中此菌含量大于1×105CFU/g·mL時，就可能引起食物中毒。試驗腐乳樣品中蠟樣芽孢桿菌數大于1×105CFU/g的概率為20%。蠟樣芽孢桿菌風險因子較高的為干型腐乳。從配料方面來看，干型腐乳中未加入白酒。腐乳生產工藝沒有殺菌過程，對微生物的抑制作用主要靠高鹽和高酒精作用，而干腐乳中沒有加白酒，故其對微生物的抑制作用相比其他類型的腐乳來說較弱，受雜菌污染的可能性更大。白方腐乳不加油，結果顯示蠟樣芽孢桿菌數較少，這與白方腐乳生產企業控制要求要高有關。而加入食用油的腐乳中此菌數量比白方腐乳多，但比干型腐乳少，這可能與加工中熱油較好地將產品空氣排除且工藝相對粗放有關。豆醬成品經灌裝殺菌后蠟樣芽孢桿菌檢出率一般較低，但試驗中樣品6檢出了此菌且含量大于可接受臨界值，可能是加工過程中殺菌不徹底或是在運輸銷售過程中受到外界雜菌污染。所測豆豉樣品均經高溫炒制，炒制過程能起到良好的殺菌作用。但豆豉樣品中所測出的蠟樣芽孢桿菌數仍有1×102～1×105CFU/g，數量較多，由此可見，豆豉制作中高溫炒制時間和溫度需要有保障。

3 結論

蠟樣芽孢桿菌是條件致病菌，廣泛分布于自然界中，食品中蠟樣芽孢桿菌的來源主要是外界污染[8]。在本次調查中發現，豆制品中普遍存在蠟樣芽孢桿菌，檢出率較高，其中豆豉、腐乳中蠟樣芽孢桿菌數大多偏高。與其他學者的研究結果比較相符。如周婷婷[9]在豆制品樣品中發現腐乳中蠟樣芽孢桿菌檢出率84.2%。不過已有研究表明蠟樣芽孢桿菌在加工過程中可通過加入輔料等方式對其進行控制。如穆可云[10]發現大蒜提取物對腐乳中的蠟樣芽孢桿菌有抑制作用，但這些控制措施并不完善。建議加強豆制品中蠟樣芽孢桿菌的檢測，并制定相應的限量標準，與國際接軌，降低食物中毒風險。

參考文獻：

[1]劉斌.食品微生物檢驗 [M].北京：中國輕工業出版社，2016：271-275.

[2]S Tusgul，G Prod'hom，L Senn， et al.Bacillus cereus bacteraemia： comparison between haematologic and nonhaematologic patients[J].New Microbes and New Infections，2017，15 （3）：65-71.

[3]周婷婷，易敏英，相大鵬，等.白腐乳及其生產過程中蠟樣芽孢桿菌的污染及防治 [J].中國釀造，2014，33（5）：77-80.

[4]謝來球，瞿麗開.136例蠟樣芽孢桿菌食物中毒案例分析[J].食品安全導刊，2017（6）：31-34.

[5]蔣榮榮，劉曉云，陳雅蘅，等.豆豉中蠟樣芽孢桿菌污染情況分析 [J].中國釀造，2013，32（3）：67-69.

[6]褚發軍，冉陸，馬莉，等.2008—2010年全國突發公共衛生事件網絡報告食物中毒流行病學分析 [J].中國食品衛生雜志，2012，24（4）：387-390.

[7]廖文生.腐乳生產過程中蠟樣芽孢桿菌污染風險評估和控制措施 [J].檢驗檢疫學刊，2015，25（5）：46-48.

[8]王為民，王燕萍.1起蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒調查報告 [J].中國校醫，2016，30（11）：832，834.

[9]周婷婷.蠟樣芽孢桿菌在腐乳中的污染狀況及其控制方法研究 [D].廣州：華南理工大學，2013.

[10]穆可云.大蒜提取物對蠟樣芽孢桿菌的抑制研究 [D].廣州：華南理工大學，2013.◇