肉毒毒素抗癲癇作用的研究進展

黃 智 連亞軍 武守義

鄭州大學第一附屬醫院神經內科，河南 鄭州 450052

肉毒毒素(botulinum neuro toxin，BoNT)是一種由厭氧梭狀芽孢桿菌產生的神經毒素蛋白[1]，可阻礙周圍神經元軸突末梢釋放乙酰膽堿，引起肌肉弛緩性麻痹、腺體分泌減少等，被廣泛應用于醫學、美容等行業[2]。根據抗原學分類，BoNT可分為8類，依次命名為BoNT/A-H，并可依據氨基酸序列進一步區分亞型[3]，如A型肉毒毒素(botulinum toxin A，BoNT/A)可分為7種亞型(A1-A7)，各亞型具有不同的酶活性及毒理學特征[4-6]。

厭氧梭狀芽孢桿菌合成并釋放無活性的BoNT前體，BoNT由1條分子質量約150 kD的蛋白鏈構成，可被自身的蛋白水解酶降解、激活，活化后的BoNT由1條約100 kD的重鏈和1條約為50 kD的輕鏈構成，并依靠一個二硫鍵相連接。重鏈的C末端特異性識別神經元表面神經節苷脂、突觸囊泡蛋白2、成纖維細胞生長因子受體[7-8]，介導輕鏈以囊泡的形式進入胞質，并參與囊泡的酸化，輕鏈的N末端允許其進入胞質。輕鏈作為BoNT的活性部分，具有Zn2+依賴的蛋白水解酶活性，可降解1種或2種構成可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感性因子附著型的蛋白受體(soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein attachment protein receptors，SNAREs)復合體的蛋白質，抑制神經遞質的釋放。

在遞質囊泡運輸過程中，SNAREs起到至關重要的作用[9]。根據其分布及功能，SNAREs分為靶膜上的SNAREs(target membrane SNAREs，t-SNAREs)和囊泡上的SNAREs(vesicle membrane SNAREs，v-SNAREs)，其中t-SNAREs包括突觸融合蛋白(syntaxin)、突觸囊泡相關蛋白25(SNAP-25)，v-SNAREs包括突觸小泡締合性膜蛋白(synaptic vesicle-associated membrane protein，VAMP / synaptobrevin)及其相關蛋白。Synaptobrevin、syntaxin 和SNAP-25聚合成SNAREs復合體，介導囊泡膜與細胞膜結合并形成融合孔，融合孔擴張，釋放神經遞質[10]。BoNT降解囊泡運輸過程中相關的SNAPEs蛋白，阻礙神經遞質的釋放，如BoNT/A、BoNT/C、和BoNT/E水解SNAP-25，BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F，和BoNT/G水解synaptobrevin，BoNT/C水解SNAP-25，及syntaxin[11]，而BoNT/H于2013年被發現，因其潛在的劇毒性，相關的研究報道較少[12]。

在周圍神經系統中，BoNT主要抑制神經肌肉接頭、自主神經末梢乙酰膽堿遞質釋放，作用機制較為單一，而對于具有多種神經遞質的中樞神經系統，其作用范圍更加廣泛、復雜，現將其對在中樞神經元的影響概括如下。

1 抑制神經遞質釋放

既往普遍認為BoNT作用于膽堿能運動神經元、自主神經系統神經元，但實驗表明BoNT可進入多種神經元，并阻滯非膽堿能神經元突觸的神經遞質釋放。眾多神經元體外培養證實，BoNT/A可抑制谷氨酸、L-天冬氨酸、5-羥色胺、多巴胺、去甲腎上腺、γ-氨基丁酸、腦啡肽、甘氨酸、P物質、ATP、降鈣素相關基因肽[13-19]。

2 抑制神經元興奮性

BoNT抑制多種神經遞質的釋放，包括興奮性神經遞質(谷氨酸、L-天冬氨酸)和抑制性神經遞質(γ-氨基丁酸)，對神經元的興奮性具有一定的影響。Bigalke 等報道BoNT/A可抑制小鼠脊神經元的興奮性和抑制性突觸后電位[20]，隨后證實BONA/A、BoNT/C、BONE/E抑制自發性、誘發的興奮性突觸后電位[21]。研究[18]表明，相較于抑制性神經遞質，BoNT對興奮性神經遞質的抑制作用更顯著 。在大鼠海馬組織中，與谷氨酸能神經元相比，γ-氨基丁酸能神經元內SNAP-25含量較低，對BoNT-A、BoNT-E的抵抗作用較強，大劑量的BoNT-A才產生抑制作用[22]。

3 抑制Na+通道

SHIN等[23]發現，BoNT/A抑制河豚毒敏感、不敏感性Na+通道，呈劑量依賴性，且對中樞性神經元的抑制作用強于周圍神經元細胞。A2型較A1型抑制作用更強，對Na+通道的抑制作用強于抗癲癇藥物(苯妥英、拉莫三嗪)，證實BoNT/A2 可影響海馬CA1區神經元Na+電流波幅，表現為前期波幅短暫增加，隨后出現持續8～10 min的波幅降低。作者認為前期短暫的波幅增加同BoNT重鏈介導的輕鏈穿過細胞膜相關，進而推測BoNT結合鈉離子通道的位點位于細胞膜內[23]。

4 逆軸突轉運及轉胞吐作用

通常認為BoNT作用于局部，而忽略了其可擴散至遠端組織。目前研究[24]表明，BoNT具有逆軸突轉運及轉胞吐作用，可逆行性傳遞至中樞神經系統。因BoNT/A特異性切割SNAP-25，可將切割后的cSNAP-25(cleaved SNAP-25，cSNAP-25)作為BoNT的標志物。ANTONUCCI等[24]在大鼠一側的海馬區注射BoNT/A，可在同側內嗅皮質、對側海馬區探及cSNAP-25，并抑制對側海馬的活動。在視區頂蓋、晶須處注射BoNT/A，在視網膜突觸末端、面神經核檢測到cSNAP-25，后續研究在視網膜雙極細胞、感光細胞內發現突觸囊泡數目異常增多，證實了BoNT可經轉胞吐逆行并發揮作用[25]。Matak等[26]在大鼠坐骨神經內注射BoNT/A，在脊髓前角膽堿能神經元內探及cSNAP-25，且該傳導可被秋水仙素抑制。一項在對腦卒中患者外周肌內注射BoNT研究中發現BoNT/A可通過軸索運輸至脊髓，抑制脊髓回返旁路與任肖細胞間乙酰膽堿釋放，降低脊髓回返抑制途徑[27]。BoNT逆軸突轉運及跨突觸傳遞的機制尚未明確，具體過程還需進一步研究。

5 可逆性損害認知、記憶等高級功能

在動物腦組織內給予BoNT，可抑制5-羥色胺、多巴胺遞質的釋放，與離體神經元培養結果相符[28-29]。在成年大鼠內嗅區皮質注射BoNT/B，可出現學習和記憶功能損害[30]，另一項研究顯示，在小鼠腦室內注射BoNT/A、BoNT/B，小鼠出現一系列癥狀，如立毛、體質量降低、體溫下降、眼瞼閉合、反射消失、呼吸困難甚至死亡[31]，而采用亞致死劑量，小鼠出現辨別新事物等行為障礙[32]。COSTANTIN等[33]實驗表明，該認知功能損害具有可逆性，將BoNT/B注射至海馬區域，大鼠出現了為期5周的可逆性的空間學習、記憶功能損，且持續時間與BoNT/B代謝的時間相符。盡管該研究表明BoNT對大鼠的學習、記憶功能可隨BoNT的降解而恢復，但尚缺乏長期用藥的研究及對大鼠行為學影響的全面評估，及對中樞不同神經核團的影響。

癲癇是多種原因引起的腦部神經元高度異常同步化放電所致的臨床綜合征，具有持續存在的能產生癲癇發作的腦部持久性改變[34]。癲癇的發病機制復雜，目前認為是中樞神經系統的興奮性與抑制性失衡所致，與興奮性、抑制性神經遞質、離子通道、神經膠質細胞、遺傳、炎癥、免疫等有關[35]。上述實驗證實BoNT可阻礙多種神經遞質的釋放，對興奮性神經遞質抑制作用較強，為治療癲癇提供了理論依據。

COSTANTIN[33]于2005年報道在大鼠單側海馬預注射BoNT/E，可抑制Ca2+依賴性鉀通道誘發的谷氨酸釋放、海馬錐體細胞的尖波電活動，顯著抑制海人酸誘發的局灶性及全面性癲癇發作，增加電刺激誘發癲癇發作的閾值，延遲癲癇的發生，減少神經元凋亡。在海馬組織中，cSNAP-25可存在3周以上，注射后1周行水迷宮訓練，BoNT組出現學習記憶障礙；而cSNAP-25經過5周后不能檢測到，此時BoNT組水迷宮測試與空白組無明顯差異，證實了BoNT/E可抑制癲癇發作，對認知功能的損害具有可逆性，與經典抗癲癇藥物苯妥英鈉對照中，進一步證實BoNT/E更為有效。

ANTONUCCI等[36]進一步研究了BoNT/E對于慢性癲癇模型的影響，在小鼠海馬注射海人酸誘發癲癇持續狀態3 h后給予海馬區注射BoNT/E，可延長慢性癲癇的潛伏期，但治療組和對照組均出現慢性癲癇，每日的發作次數及時間無差異。在海人酸注射側海馬CA1區神經的元喪失及齒狀回細胞分散程度降低[37]。該試驗揭示了BoNT/E在癲癇形成中的保護性作用，但對慢性癲癇的產生無明顯影響。而另一項研究選取海人酸注射3周后的慢性癲癇模型，給予海馬區注射同等計量的BoNT/E，發現可降低大鼠每日癲癇的發生次數及持續時間。

BoNT/A、BoNT/B同樣具有抗癲癇作用，在杏仁核點燃模型中，二者均增加電刺激的閾值，抑制谷氨酸釋放，呈現劑量、時間依賴性，其中BoNT/B可持續50 d，較BoNT/E明顯延長[38]。在對于 BoNT/A的不同亞型研究中，在杏仁核點燃模型中海馬注射等劑量的A1、A2型BoNT，并統計術后電刺激的閾值及癲癇發作狀態，發現BoNT/A2可提高電刺激閾值，降低癇性發作，而BoNT/A1組較空白組無明顯差異[39]，可能因A1型擴散速度較A2型快，A1型擴散范圍較廣，局部不能形成有效濃度，不能抑制局部電刺激誘發的癲癇發作。

以上研究均采用顱內海馬區局部注射，操作具有創傷性及感染風險，在實際操作中具有一定的難度，不利于應用到臨床實踐中，應進一步探究顱外無創給藥途徑。近年來研究發現，經鼻腔給藥可經嗅神經、三叉神經通路傳遞至中樞神經系統，并具有繞過血腦屏障、生物利用度高、無肝臟首過效應等特點[40]，被用于研究帕金森病、腦缺血、阿爾茨海默病等中樞神經系統疾病的治療[41-42]。嗅神經可投射至腦的不同區域，如梨狀皮質、杏仁核、下丘腦等[43]，目前實驗證實鼻腔給予miR-146a mimics可延遲氯化鋰-匹魯卡品癲癇模型的癲癇發作[44]。因BoNT的逆神經轉運、轉胞吐作用，利用嗅神經傳導通路，可探究鼻腔內給藥對于癲癇發作的影響。

后續可進一步利用BoNT不同的類型的酶活性及毒理學特征，如BoNT/A半衰期時間長，可能作為潛在的長效抗癲癇藥物，避免常規抗癲癇藥物需長期、規律服用的弊端；BoNT/E作用時間短暫，可應用于癲癇外科，對不能明確的手術切除部位暫行局部注射，有助于進一步精確定位。綜上，目前研究表明，BoNT可抑制神經元興奮性，減少癲癇的急性期發作及慢性自發癲癇發作，降低神經元損傷、腦部異常放電，為癲癇的治療提供了新的途徑，但目前尚處于實驗階段，還需進一步探索。

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