TGF-β信號通路與軟骨終末分化及骨關節炎

萬小滿，閆繼紅

(1.首都醫科大學基礎醫學院 13級七年臨床醫學兒科，北京100069；2.首都醫科大學基礎醫學院 組胚教研室)

骨關節炎(OA)是一種慢性退行性關節疾病，在中老年人群中發病率高，嚴重者可致殘，從而影響人們的生活質量。

其病理改變涉及關節整體結構，包括關節軟骨破壞，軟骨下骨硬化，骨贅形成以及滑膜增生等[1]。目前已知的有關病因主要與年齡、性別、力學壓力(肥胖)以及創傷有關[2]。然而有關骨關節炎發生的精確的分子機制目前還不完全清楚。

最近轉基因小鼠研究表明轉錄生長因子-β(TGF-β)信號通路在OA的發展中發揮關鍵的作用，可促進軟骨細胞向肥大化發展，促進骨原細胞分化成成骨細胞和軟骨下骨中的血管生成，以及刺激滑膜相關細胞增殖和滑膜的纖維化[3]。

TGF-β信號通路是一個包含眾多成員的多功能細胞因子的超家族，主要調節細胞的生長、增殖、分化、遷移和凋亡等過程[4]。在軟骨發生中，TGF-β信號發揮著重要的功能，包括間充質細胞聚集、軟骨細胞增殖、細胞外基質沉積和最后終末分化都起重要作用。有研究報道：TGF-β不僅可以引發軟骨基質的合成，而且也可以參與OA的發生及發展過程。如參與：(1)募集前成骨細胞；(2)軟骨下骨的病理重建；(3)骨贅的形成，促進軟骨細胞的終末分化等。本文就目前TGF-β信號通路在骨關節炎的發生中的有關調節機制予以綜述。

1 TGF-β信號通路

目前已知在TGF-β信號通路超家族中除了 TGF-β外，還包括活化素(activin)、抑制素(inhibin)、生長分化因子(GDFs)、骨形態發生蛋白(BMPs)等不少于35個成員組成。TGF-β超家族信號通路中與軟骨發育有關的主要為Smad2/3介導的TGF-β信號通路與Smad1/5/8介導的BMP信號通路。其中由TGF-β信號引發的Smad信號通路在軟骨和骨關節炎的發生中越來越受到關注。經典TGF-β信號通路(BMP信號通路作用類似)主要通過TGF-β配體-膜受體(Receptor)-Smad信號通路發揮誘導成軟骨的生物功能。TGF-β受體分為TβRⅠ型、TβRⅡ型和TβRⅢ型，其中TβRⅠ起著承上(與TGF-β結合)和啟下(活化Smads)的作用，配體與TGF-βR結合導致TGF-βRⅡ磷酸化，活化的Ⅱ型受體構象發生改變并識別Ⅰ型受體，對Ⅰ型受體胞內側絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化，活化后的Ⅰ型受體活化細胞內效應分子Smad，進而調控一系列生物學功能[3]。

1.1 TGF-β配體

在哺乳動物中，有三種TGF-β，TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，[5]且這3種TGF-β在軟骨細胞與肥大的軟骨細胞中均有表達[6]。

TGF-β是間充質前體細胞軟骨發生的主要發起者，間充質干細胞(MSCs)分化為軟骨細胞也需要TGF-β的作用，通過TGF-β的強烈刺激誘導N-鈣粘蛋白的表達，來增強細胞粘附，使細胞聚集。隨后促進細胞的增殖以及軟骨特異性細胞外基質分子的沉積[7]。研究表明TGF-β是通過調控Sox9的表達來作為軟骨分化的正調控因子[8]。

大量研究已表明TGF-β與對軟骨發生具有重要的作用。研究發現TGF-β3可以刺激細胞外基質的合成，在急性軟骨損傷的兔子模型中，可以提高軟骨的細胞外基質的量[9-11]。

注射有活性的TGF-β1在受損的軟骨區，可分泌Ⅱ型膠原蛋白以及產生粘連蛋白使軟骨細胞能附著在受損部位[12，13]。最新的研究結果類似，Tang，Y等人通過腺病毒將TGF-β1基因轉染到兔子軟骨細胞中，結果顯示TGF-β1可以長時間的發揮作用，包括使軟骨細胞由多邊性變為梭形或卵圓形，DNA合成以及聚蛋白多糖及Ⅱ型膠原蛋白表達均增加，而Ⅰ型膠原纖維表達明顯減少，另外明顯促進軟骨樣基因Sox9的mRNA的表達，并阻止肥大標志物COL10A1，減少MMP-13[14]。還有研究表明，TGF-β1可以有效的阻斷BMP9誘導的Smad1/5磷酸化和軟骨肥大樣改變[15]。

然而一些研究則顯示，TGF-β對軟骨還存在一些負面作用。它能誘導人的軟骨細胞MMP-13[16]和馬正常軟骨細胞的MMP-9[17]的合成增加。對于滑膜細胞，能增加MMP-1、聚蛋白多糖酶以及促炎因子的表達[18]。這些基因表達的提高會導致軟骨分解的加速。而局部TGF-β的聚集將會導致關節軟骨產生骨關節炎樣變化。在體外和動物模型中也都證明TGF-β信號與骨關節炎的發生相關。體內的實驗證明，在骨關節炎的發展中，TGF-β1和BMP2作為配體，活化Smad3，促進MMP13的表達，導致人骨關節炎的發生和正常軟骨的破壞[19]。另外，異常激活TGFβ1導致軟骨下骨異常重塑和骨髓骨樣小島的形成[20]。

這些實驗結果表明，TGF-β在軟骨和骨關節炎的發生中的作用是存在爭議的。

1.2 TGF-β受體

TGF-β受體分為TβRⅠ型、TβRⅡ型和TβRⅢ型，其中TβRⅠ起著承上(與TGF-β結合)和啟下(活化Smads)的作用。研究發現，軟骨細胞TGF-β不僅通過經典的Ⅰ型受體ALK5介導Smad2/3信號，而且還可以通過ALK1受體介導Smad1/5/8通路[21]。

通過受體ALK5磷酸化Smad2/3的TGF-β信號通路可以使軟骨分化開始，但對軟骨終末分化有阻止作用。而通過受體ALK1/2/3磷酸化Smad1/5/8的BMP信號通路對于軟骨終末分化是有重要意義的，缺失Smad1和Smad5會阻礙軟骨細胞終末分化，并造成軟骨功能障礙。

有研究表明，隨著年齡的增加會減少ALK1的表達，但是，它減少的速度不如ALK5，提示在老化的軟骨細胞中，會由通過ALK5的Smad2/3信號通路轉向通過ALK1的Smad1/5/8信號通路，ALK5/ALK1比例的減小會導致軟骨細胞向骨關節炎特征表型的肥大方向分化[22]。van der Kraan等[22]的實驗也獲得相似的結果，年齡可導致ALK1/5的比例改變，發生軟骨肥大，此外，還發現人的骨關節炎軟骨中ALK1與MMP13的表達呈現出顯著的相關性。由此可見，在骨關節炎的軟骨細胞中，ALK5的減少改變了ALK5和ALK1的比例，從而TGF-β信號偏向于Smad1/5/8信號通路，使軟骨細胞發生終末分化。

1.3 Smad蛋白

Smad主要可分為三類，調節受體型Smad：Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8，通用型：Smad4，負調節型Smad:Smad6和Smad7[24]。

大量研究證明負調節型Smad通過招募泛素化酶作用于相關蛋白，引起信號關閉。常見的泛素化酶包括Smurf1和Smurf2。

已有研究顯示Smad6和Smurf1是Smad1/5/8的BMP信號通路的抑制物，而Smad7和Smurf2則抑制Smad2/3信號通路。Smad6和Smurf1過表達的大鼠軟骨細胞中顯示正常的細胞增殖狀態，阻礙了軟骨細胞終末分化。在分化的雞軟骨細胞中，Smad6的過表達阻斷BMP-2誘導的軟骨細胞肥大。此外Smad6可與Runx2相互作用，增強Runx2通過蛋白酶體途徑降解。相反，在軟骨細胞中過表達Smad7，抑制了Smad2/3信號減少了軟骨細胞增殖，加速軟骨細胞的終末分化[24]，促進骨關節炎的發生。此外，Smad7可下調p38MAPK蛋白激酶信號通路，阻止前軟骨細胞的分化過程[25]。

Smurf不僅可促進Smad降解而且可調節ALK半衰期。過表達Smurf1可通過減少Smad5，抑制Smad1/5/8信號，防止終末分化。相反，過表達murf2可下調ALK5水平[26]，抑制Smad2/3信號，加速軟骨終末分化，促進骨關節炎發生[27]。發現對體內發現Smurf2功能缺失的小鼠可以減緩半月板損傷后骨關節炎發生的嚴重程度[28]。

由此可知：過表達Smad7和Smurf2或下調Smad6和Smurf1都會引起軟骨終末分化，促進骨關節炎的發生。

2 機械壓力與TGF-β信號通路

在引起骨關節炎發展的主要因素中，一個是生物因素，另一個重要因素是壓力誘導的軟骨損傷。

動物實驗研究表明，關節負荷過重會導致Sox9，Ⅱ型膠原蛋白表達減少，表現為關節軟骨丟失和軟骨下骨密度降低[29]。

有研究表明，機械壓力會抑制軟骨中ALK5介導的Smad2/3通路的激活，但與年齡有關。老齡軟骨對機械壓力引起的ALK5-Smad2/3通路抑制作用更加明顯著，Ⅱ型膠原蛋白和纖維粘連蛋白表達相對于年輕軟骨大大減少[30]。有研究表明，人關節軟骨機械損傷導致Smad1和Smad5的磷酸化，Wnt信號上調，進而改變R-Smad信號平衡，刺激軟骨細胞的終末分化[31]。

軟骨細胞凋亡與骨關節炎密切相關[32]。 最近有研究顯示，機械壓力可通過上調miRNA-146a，進而抑制Smad4蛋白表達，誘導軟骨細胞凋亡，促進OA的發生[33]。

但也有實驗表明，過度的機械壓力單獨不會造成TGF-β信號由Smad2/3向Smad1/5/8轉變，相反，可保護關節軟骨，阻止軟骨的終末分化[34]。

3 TGF-β信號與其它信號通路交互共同調節軟骨分化

3.1 Wnt信號通路

Wnt信號系統在軟骨分化和軟骨發育中起重要作用。增強Wnt信號可直接對軟骨細胞分化產生影響，也可以通過調節Smad2/3和Smad1/5/8途徑的平衡來產生效應。 有研究證實，經典的Wnt信號通路可以使TGF-β信號通路由ALK5介導的Smad2/3信號通路轉向ALK1介導的Smad1/5/8的BMP信號通路，導致軟骨細胞肥大，這可能是骨關節炎的病理機制之一[35]。

3.2 MAPK信號通路

研究發現，在OA軟骨中，p38MAPK的磷酸化增強[35]。 MAPK磷酸化，將改變Smad2/3與Smad1/5/8信號之間的平衡，促進軟骨終未分化[36]。

TGF-β可依賴p38信號通路介導Smad通路調節Sox9的磷酸化及其下游基因papss2 mRNA的表達。Sox9上第211個絲氨酸的作用位點負責應答TGF-β信號，而這個位點也是p38激酶的一個靶點，p38和Smad3可共同調節Sox9的表達[37]。

此外，TGF-β1通過 ERK1/2激酶磷酸化Smad3，誘導基質蛋白酶抑制劑(TIMP-3)的上調[38]，而單獨ERK1/2并不能發揮作用。

4 TGF-β在治療骨關節炎中的應用

TGF-β家族，主要包括TGF-β1、TGF-β3或BMP-2，已證明能促進軟骨再生，而用于軟骨組織工程中。

TGF-β1可以抑制軟骨基質降解酶和促進軟骨分解代謝的細胞因子白介素(IL)1。另外，TGF-β1能增強骨髓間充質干細胞的成軟骨能力。因此，TGF-β1可作為軟骨修復一個不錯的選擇[39]。臨床試驗證明，TGF-β1基因修飾的軟骨細胞，具有修復損傷的軟骨的作用[40]。有研究顯示TGF-β3基因通過病毒感染到MSCs，可治療OA引發的軟骨損傷[41]。

然而，注射高劑量的TGF-β1進入關節內可誘發炎癥細胞的趨化和激活，導致典型的軟骨缺陷如纖維化和骨贅的形成[42]。因此，TGF-β1應該管理在合適的范圍內，將負面影響降到最低。

此外，由于TβRⅡ與軟骨細胞基質的表達具有相關性。因此可以在軟骨細胞中高表TβRⅡ或者ALK5作為治療骨關節炎的手段。

5 問題與展望

目前，我國人群中骨關節炎的發病率很高，嚴重地影響了人們的生活質量。由于骨關節炎病因復雜，目前臨床上尚無有效的治療手段和藥物。闡明骨關節炎發病的分子機制對于更深入地研究有效的治療方法具有重要的意義。

TGF-β信號通路在調節關節軟骨的再生起了非常重要的作用，TGF-β信號通路中各種分子將可作為OA治療的靶點。因此，合理掌握TGF-β使用的劑量，通過阻滯ALK1，選擇性激活不同的Smad信號以及關鍵的下游靶基因，可以作為治療和干預OA疾病的潛在關鍵目標[3]。

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