CD200表達(dá)與結(jié)直腸癌的關(guān)系研究

劉俊婷，侯睿達(dá)，安治國，毛靜濤，侯治富*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033；2.北京龍邁達(dá)斯科技開發(fā)有限公司，北京101111)

CD200屬于白細(xì)胞分化抗原，是一種Ⅰ型膜糖蛋白[1]，胞膜外區(qū)有兩個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。CD200在人類和嚙齒類動(dòng)物均有表達(dá)，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元細(xì)胞、活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、濾泡樹突細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等[1，2]。CD200的主要受體為CD200R，CD200與CD200R的相互作用可作為免疫耐受信號，影響髓細(xì)胞的活性，降低它們的遷移作用[3]。CD200R表達(dá)相對局限，主要分布于髓系來源的細(xì)胞(如樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等)及淋巴細(xì)胞[4]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)CD200高表達(dá)見于結(jié)腸癌、骨髓瘤、乳腺癌、腦瘤、黑色素瘤和正常間質(zhì)干細(xì)胞[5]。因此研究CD200在結(jié)腸癌的表達(dá)以及作用機(jī)制，可為結(jié)腸癌腫瘤免疫調(diào)節(jié)的研究提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)篩查了43例結(jié)腸癌病例，26例癌旁正常組織。由北京龍邁達(dá)斯科技開發(fā)有限公司制作組織芯片。組織芯直徑為1.5 mm，切片厚為2 μm，組織芯數(shù)為69芯。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法[6]

(1)將組織芯片切片浸泡于二甲苯中20 min，換新鮮二甲苯重復(fù)一次，進(jìn)行脫蠟處理；分別配制100%酒精、95%酒精、90%酒精、80%酒精、70%酒精、蒸餾水梯度溶液，將脫臘后的組織切片置于100%乙醇浸泡5 minx2次；

(2)依次置于95%酒精、90%酒精、80%酒精、70%酒精、蒸餾水中各浸泡5 min進(jìn)行水化；

(3)用微波高火加熱抗原修復(fù)液檸檬酸-檸檬酸鈉至沸騰，然后放入切片，再用微波高火加熱5 min，補(bǔ)充蒸餾水恢復(fù)體積后再用微波高火繼續(xù)加熱5 min；

(4)將芯片取出，室溫條件下待其自然冷卻，用新鮮配置的3%H2O2(現(xiàn)用現(xiàn)配)滴片，于室溫下避光孵育10 min；

(5)用PBS洗滌5 min，以去除內(nèi)源性過氧化物酶；

(6)室溫條件下，用10%正常羊血清封閉10 min。

(7)加入1∶50抗CD200抗體(購于美國Abcam公司)，同時(shí)用PBS配制的10%正常羊血清作為實(shí)驗(yàn)陰性對照，置于4℃，過夜；

(8)然后用PBS洗滌3次，每次5 min；嚴(yán)格按Dakocytomation Envision + TM System HRP試劑盒的說明書的操作進(jìn)行染色；

(9)染色后用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，用中性樹膠封片；

(10)光學(xué)顯微鏡下觀察，記錄結(jié)果。

1.3 結(jié)果判定

CD200的表達(dá)定位于細(xì)胞膜，陽性產(chǎn)物均為黃色或棕黃色顆粒。結(jié)果根據(jù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度以及陽性細(xì)胞在全部組織細(xì)胞中所占比例判定：A：按細(xì)胞顯色深淺記分，棕褐色為3分，棕黃色為2分，淺黃色為1分，無陽性反應(yīng)細(xì)胞為0分。B：按顯色細(xì)胞數(shù)記分，陽性細(xì)胞數(shù)>75%為4分，陽性細(xì)胞數(shù)≥51%-75%為3分，陽性細(xì)胞數(shù)≥26%-50%為2分，陽性細(xì)胞數(shù)≥5%-25%為1分，陽性細(xì)胞數(shù)<5%為0分[6]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

通過芯片技術(shù)對樣本進(jìn)行免疫組化檢測，其中結(jié)腸癌和癌旁正常組織的表達(dá)范圍分為五個(gè)等級，強(qiáng)度分為四個(gè)等級。結(jié)腸癌組織芯片的免疫組化結(jié)果如表1 和表2所示。對樣本CD200 表達(dá)的范圍和強(qiáng)度進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明： CD200 在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度與表達(dá)范圍均高于正常組織(P=0.001)。

表1 結(jié)腸癌樣本CD200表達(dá)范圍

表2 結(jié)腸癌樣本CD200表達(dá)強(qiáng)度

3 討論

大腸癌在西方國家居癌癥引發(fā)死亡的第三大殺手[7]，在我國也是最常見的消化道腫瘤之一，我國發(fā)病率也呈逐年增長的趨勢，因此，積極開展結(jié)腸癌的防治研究具有重大科學(xué)意義。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，CD200的表達(dá)在某些腫瘤組織(如結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌、腦瘤等)中較高[9]，且在抑制腫瘤免疫方面具有重要作用，提示其是一個(gè)潛在的腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志。本文研究結(jié)果顯示，CD200 在結(jié)腸癌組織中高度表達(dá)，正常結(jié)腸組織中CD200的表達(dá)強(qiáng)度和范圍均低于結(jié)腸癌組織(P=0.001)。CD200/CD200R的相互作用可以傳遞免疫抑制信號，是體內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)的維持的參與者。然而，無論在實(shí)體腫瘤還是血液腫瘤中，CD200的表達(dá)均升高。有學(xué)者指出CD200 高表達(dá)可作為結(jié)腸癌患者的重要標(biāo)志，CD200 分子的高表達(dá)與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)系。結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示 CD200 的表達(dá)在促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展及結(jié)腸癌預(yù)后的研究中具有重要意義。

有研究指出，與CD200-結(jié)腸組織細(xì)胞相比，CD200+結(jié)腸細(xì)胞較易形成腫瘤細(xì)胞，同時(shí)，體外實(shí)驗(yàn)顯示 CD200+結(jié)腸癌細(xì)胞有更強(qiáng)的侵襲性。研究者將表達(dá)CD200的腫瘤接種在NOD/SCID小鼠中，發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞對腫瘤的清除作用被其抑制，而加入CD200抗體后，該抑制作用被中和[5]。此外，CD200對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的誘導(dǎo)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生方面有作用，因此通過阻斷抑制CD200分子的作用，對高表達(dá)CD200的腫瘤的治療具有潛在的價(jià)值。

Kawasaki BT[8]等研究發(fā)現(xiàn)，CD200可表達(dá)于大腸癌的干細(xì)胞中，是潛在的干細(xì)胞表面標(biāo)志物和免疫抑制因子，認(rèn)為大腸癌干細(xì)胞可能通過表達(dá)CD200，依賴其介導(dǎo)的免疫機(jī)制來逃避免疫監(jiān)視，表明CD200的表達(dá)是大腸腫瘤干細(xì)胞和腫瘤免疫之間重要的橋梁。同時(shí)，腫瘤干細(xì)胞也可能以分泌多種免疫抑制因子的方式來抑制機(jī)體的免疫系統(tǒng)，從而在腫瘤干細(xì)胞周圍形成一個(gè)免疫耐受的微環(huán)境，促使腫瘤發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[10]。通過基因芯片分析CD44+CD133+結(jié)腸癌COLO205細(xì)胞和CD200+結(jié)腸癌細(xì)胞的表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，很多基因在兩種細(xì)胞中的表達(dá)都增高[11]，均提示大腸癌干細(xì)胞可以通過CD200依賴的免疫機(jī)制抑制腫瘤免疫。因此阻斷CD200的作用，對于高表達(dá)CD200的腫瘤的治療具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的結(jié)腸癌組織中CD200高表達(dá)的結(jié)果表明，通過阻斷CD200分子的免疫抑制作用，對結(jié)腸癌治療具有潛在的前景。

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