植物細胞質雄性不育和育性恢復基因調控機制研究進展

周小利，楊詩怡，陳志蕓，索文龍，牛永志，馬文廣，廖菊夠，顧 菁，陳穗云

（1云南大學云南省高校植物病蟲害生物防控工程研究中心，昆明650091；2玉溪中煙種子有限責任公司，云南玉溪653100；3云南省煙草農業科學研究院，云南玉溪653100）

0 引言

植物雄性不育(male sterility，MS)是指雌配子正常發育，雄配子發育異常，能接受外來正常花粉受精結實的現象。目前為止，有610個植物種被報道存在雄性不育類型[1]，包括細胞質雄性不育(CMS)和細胞核雄性不育(GMS)，前者由線粒體基因偶聯核基因共同控制，后者僅由核基因單獨導致[2]。雄性不育植株一般表現為3種類型：一是花藥退化和干癟，僅花絲部分殘存；二是花藥內不產生花粉；三是產生的花粉敗育。其中花粉敗育可能是由于溫度過低或者嚴重干旱等外界因素，使花粉母細胞不能正常進行減數分裂，導致不能形成正常發育的花粉；另外，絨氈層細胞異常，也會造成花粉敗育。迄今為止，細胞質雄性不育現象己經在水稻、玉米、油菜、棉花、小麥、高粱、大豆等主要農作物和洋蔥、辣椒、菜豆、向日葵等園藝作物中發現。雜種優勢是雜合體在一種或多種性狀上優于2個親本的現象[3]，利用雜種優勢產生了巨大的全球作物生產的經濟效益[4]。在雜交育種實踐中，利用雄性不育可以免去人工去雄節約勞力，是雜交種子生產的理想材料。利用胞質雄性不育系、恢復系和保持系的三系配套制種，已成為國際制種業的主要趨勢，可節省大量的人力物力，并能提高雜交種子的純度和雜交親和性[5]。CMS已被廣泛運用于玉米、水稻、油菜和向日葵等的雜交育種實踐[6-7]，取得了良好的社會經濟效益。

細胞質雄性不育(CMS)又稱為核質互作雄性不育，由線粒體不育基因和核恢復基因(restorer of fertility,Rf)共同調控。細胞質線粒體基因產物導致雄性不育，而細胞核育性恢復基因(Rf)產物能改變線粒體中不育基因的轉錄或表達，使不育系恢復育性[8]。CMS不僅是植物生殖生物學研究中的一個重要性狀，也是研究作物雜種優勢利用的一個重要農藝性狀，在作物育種和分子生物學研究中具有重要地位[9]，CMS系還是研究植物核質互作的理想模型。前人針對不同物種CMS的遺傳調控機制開展了大量研究，希望能揭示CMS的作用機制和途徑。以往的研究主要集中在形態學和細胞學等方面，近幾年來，在分子生物學實驗技術的不斷發展下，植物基因組的研究也在不斷深入，CMS分子機制的研究發展主要包括確定了細胞質雄性不育的相關區域，以及該區域相關的轉錄與翻譯譜、細胞質雄性不育性的形成機制、恢復基因的作用機制及相關育性恢復基因的鑒定等方面[10]。CMS方面的研究主要是針對線粒體雄性不育基因的鑒定及其作用機制研究，細胞核育性恢復基因的鑒定，及其通過何種途徑影響線粒體不育基因，并恢復育性。但多數研究都是針對某一個特定的物種而言，并沒有系統介紹過有關植物細胞質雄性不育和育性恢復調控機制方面的內容。而且隨著分子生物學的不斷發展，更多的研究都注重育性恢復基因的克隆和鑒定，細胞質雄性不育形成的作用模型及育性恢復的調控機制研究甚少。

本研究系統總結了前人在細胞質雄性不育的機制和作用模型、細胞質線粒體不育基因、細胞核育性恢復基因鑒定、功能和作用途徑，及二者互作機理研究方面的進展，以更好地指導將來對核質互作遺傳調控機理的研究，從而使細胞質雄性不育系在雜種優勢遺傳育種中發揮更好的作用。

1 細胞質雄性不育的機制和作用模型

在CMS植株中，線粒體基因和核基因相互作用，控制植物的雄性特異性、育性發生和恢復。線粒體不育基因可能通過多種途徑導致雄性不育：一是線粒體DNA重排，引起嵌合基因或新的orf表達，表達產物多為毒蛋白，這些蛋白產物影響線粒體呼吸鏈反應和絨氈層發育，導致雄性不育[11]；二是受異質的核背景可能導致線粒體呼吸鏈復合酶基因序列出現缺失、突變等，造成基因編碼產物在氨基酸序列、親疏水性和不同結構層次的改變，并影響線粒體電子傳遞鏈及氧化磷酸化過程相關酶的正常功能，造成雄性不育[12,13]；三則可能通過基因轉錄水平發揮作用，如研究指出線粒體編碼蛋白產物的基因存在廣泛的翻譯后編輯現象，主要是C-U類型的編輯，這種翻譯后編輯與雄性不育密切相關。根據細胞質雄性不育發揮作用的不同機制，前人提出了不同的作用模型，包括細胞毒害模型、能量缺乏模型和細胞程序性死亡模型等[9,14]。

1.1 細胞質雄性不育的細胞毒害模型

在細胞毒害模型中，CMS毒蛋白直接殺死正常細胞。第一次發現的CMS系毒蛋白是玉米CMS-T的urf13基因產物，該蛋白對大腸桿菌[15-16]和許多真核細胞有毒[17-18]。自從urf13被發現以后，一些CMS毒蛋白，如向日葵CMS-pet1的ORF 522[19]，蘿卜CMS-Ogu的ORF 138[20]，新型甘藍型CMS-Hau的ORF 288[21]、水稻CMS-BT的ORF 79相繼被發現[22-23]，而水稻CMS-WA的WA352也被證明對大腸桿菌有毒。CMS毒蛋白影響孢子體和配子體線粒體功能，導致雄性不育[18]。大多數CMS蛋白質是10 k～35 kDa的跨膜蛋白，具有一個疏水區，這是典型的細胞毒蛋白特征。CMS-WA的WA 352蛋白對大腸桿菌的毒性依賴于特定的跨膜結構，但在植物中表達WA 352蛋白不含跨膜區域的片段仍然導致雄性不育[23]，表明CMS毒蛋白WA 352誘導植物雄性不育不依賴跨膜結構域。

1.2 細胞質雄性不育的能量缺乏模型

花藥的孢子體和配子體細胞需要的生物合成能量比其他器官的細胞能量要多，因此花藥細胞可能會通過增加線粒體數目或通過增加線粒體的代謝活性產生更多的能量，線粒體通過mtETC呼吸鏈傳遞生產的ATP對花粉發育至關重要。在能量缺乏模型中，線粒體CMS蛋白質會導致線粒體的能量代謝缺陷，而不能滿足雄性生殖發育能量需求。在向日葵CMS-PET1中，ORF 522編碼含有19個氨基酸蛋白的嵌合基因orfB，該基因產物可能危及F1F0-ATP酶活性[24]，導致CMS-PET1植物的ATP酶活性明顯低于可育植株。其它物種的CMS蛋白含有類似orfB序列，包括蘿卜ORF 138和ORF 125、白菜的ORF 224和ORF 222、胡蘿卜CMS的orfB，都可能通過相似的機制導致雄性不育。另外，CMS蛋白質還可能會影響線粒體膜的完整性，導致質子泄漏和能量產生不足或通過功能性同源競爭mtETC F1F0-ATP酶復合物，形成無效或低效mtETC或F1F0-ATP酶復合物干擾ATP的產生[25]，從而調控育性。

1.3 細胞質雄性不育的異常細胞程序性死亡模型

細胞程序性死亡(PCD)是指生物體在生長發育過程中，由自身基因編碼、主動和有序的死亡進程，是生物體新陳代謝過程中正常的生理反應[26]。如果啟動PCD程序的基因發生突變，或由于環境因素的改變使PCD程序不能啟動或死亡程序執行過程中被提前終止都會使花粉育性發生變化。植物中雄性不育是從小孢子發生到雄配子體發育成熟的不同階段，小孢子或雄配子體發生了異常的PCD，其中一部分是由絨氈層細胞過早或過晚發生PCD而造成的，還有一部分是在減數分裂過程中特定階段的PCD異常所引起的。目前，已在擬南芥[27]、水稻[28]、板栗[29]、白菜[30]中發現因相關的程序性死亡而引起的雄性不育現象，并且已在細胞生物學和分子生物學水平上進一步證實是通過細胞程序性死亡過程引起的雄性不育。

2 細胞質雄性不育恢復的機制

如上所述，線粒體不育基因及其產物是導致CMS的主要原因。抑制CMS基因的表達，或抵消其不育產生的負面作用是恢復育性的重要途徑，細胞核育性恢復基因(Rf)在該過程中扮演了重要角色。除玉米Rf2編碼乙醛脫氫酶外，矮牽牛Rf0[31]，油菜Rf0[32]、水稻Rf1a[33]、Rf1b[34]，蘿卜Rfk1[35]及高粱Rf1 和Rf2[36]都編碼的是由PPR基序串聯組成的PPR蛋白[37]。PPR是高等植物中最大的基因家族之一，在介導植物細胞器基因的表達上起著重要作用，能調節葉綠體和葉綠體基因的表達或RNA的剪接、編輯、加工和翻譯等[38]。Rf基因及其產物PPR蛋白可以在不同的分子水平上通過各種機制使育性恢復。關于恢復基因的作用機制：第一是恢復基因編碼的產物，彌補了由線粒體基因重排導致的育性相關基因不能正常表達的蛋白產物，使育性恢復；第二是恢復基因抑制了不育基因相關ORF的表達，消除或削弱了不育基因產物毒蛋白的影響。

2.1 恢復基因在轉錄水平上的作用

恢復基因可以抑制相關CMS基因的轉錄，從而降低不育基因轉錄產物，恢復育性。在CMS-S型玉米中，恢復基因Rf3能夠減少與不育有關的mRNA轉錄[39]；在菜豆中，恢復基因Rf2使育性恢復植株中CMS特異轉錄穩定性下降，基因表達量也下降[40]。蘿卜的恢復基因Rf0編碼3個高度相似的PPR蛋白(PPR-A、PPR-B、PPR-C)，免疫沉淀顯示在體內PPR-B與ORF l38 mRNA相關，直接或間接的作用于ORF 138 mRNA，調控ORF 138 mRNA轉錄[41]。

恢復基因也能影響CMS相關轉錄物的加工、編輯，如在甘藍型油菜恢復基因Rfp影響Pol型不育相關基因轉錄的加工，使單順反子atp6轉錄的豐度增加[42-43]；在高粱A3細胞質中，恢復基因Rf3切割線粒體基因ORF l07 mRNA的核苷酸位點，這種切割是育性恢復的必要條件[44]；實驗也證實煙草atp 9基因的編輯和育性恢復相關[45]；另外在CMS-Ogura蘿卜中也發現，恢復基因Rft能夠對ORF138轉錄產物進行加工，并調控育性[46]。在CMS-WA水稻中發現，與可育系相比，不育系線粒體基因組中的orfB轉錄物未被編輯[47]。CMS-HL水稻中的恢復基因Rf5所編碼的蛋白是育性恢復復合體的組成成分，該復合體在體外能夠切割CMS相關轉錄物[48]。

2.2 恢復基因在蛋白水平上的作用

恢復基因也可能通過減少不育基因編碼的蛋白質積累量而恢復育性[49]。在CMS-C型向日葵中，育性被Rf基因恢復的雜種與不育系轉錄模式相同，Rf基因不影響不育基因RNA的編輯，但育性恢復的雜種花藥中，不育基因編碼的16 kDa蛋白產物顯著減少[50]；CMS-Ogura型油菜的恢復基因恢復育性的雜種轉錄沒有明顯變化，但不育基因蛋白質的豐富度卻大大降低[51]；在矮牽牛中發現育性恢復植株與不育植株的線粒體不育基因ORF 138的轉錄效率相同，但恢復基因編碼產物可能降低了ORF 138編碼蛋白的穩定性，從而使ORF 138蛋白積累減少[52]；在CMS-Ogura蘿卜中也發現，Rf0并不改變ORF l38轉錄豐度，但是顯著降低葉片和花器官中ORF 138蛋白的含量[53]。

3 存在問題及展望

許多物種CMS不育基因和相應的Rf基因被鑒定，加深了人們對核質互作的雄性不育的細胞核/細胞質遺傳調控機制的認識，水稻CMS-WA、甜菜CMSOwen和胡椒CMS-Peterson等作物的不育系已成功運用于雜交育種和生產實踐。然而，CMS/Rf在一些農作物如煙草、小麥、高粱等上的研究卻一直停滯不前，另外，在胞質雄性不育系統中，CMS蛋白和Rf蛋白相互作用和線粒體逆行調節信號尚未確定，CMS蛋白特異性積累并誘導雄性不育的機制仍不清楚。雖然分子生物學技術和理論的迅速發展對CMS的研究起到了巨大的促進作用，但CMS過程涉及花發、配子體發育過程中能量的調配，基因在時間和空間上的相互作用，由于受到許多方面因素的影響，該領域的研究一直都是模糊不清的。鑒于不育系在作物遺傳育種中的重要性，需要研究更多的農作物CMS系統并將其應用于農業，以避免遺傳脆弱性，筆者認為在今后一段時間內CMS的生物學研究和應用將集中在以下幾個方面。

（1）伴隨新的研究技術發展，通過全基因組測序技術加大植物基因組研究的范圍，鑒定更多作物育性恢復系中的Rf基因；如在水稻和蘿卜中[54-56]，測定CMS系的完整線粒體基因組序列測序，提供了尋找新的不育候選ORF的有效途徑，增加了對CMS/Rf系統的認識，更助于解決目前在研究CMS/Rf系統方面的挑戰。

（2）在機制研究上，需要更詳細地了解線粒體ORF編碼的蛋白質對花粉育性影響的具體機制，以便揭示更多植物細胞質雄性不育與不育的現狀，闡明CMS/Rf的相互作用即兩者基因間相應的轉錄產物和翻譯產物的相互作用。從目前已克隆的植物CMS的Rf基因中，多數都含有PPR基序，因此一種更加方便可行的方法就是通過對基因組PPR基序的篩選來克隆植物CMS的rf基因。

（3）在雄性不育系應用方面，雄性不育系對雜種優勢明顯，在更多的植物中構建雄性不育系的植株對農作物等有巨大作用。通過利用基因工程的方法來創造不同植物種的雄性不育系，從而避免了大多數雄性不育系是通過人工雜交篩選獲得、費時費力的缺點，也避免了利用原生質體融合、轉基因等生物技術創造雄性不育系實際應用中占的比例很小的局限。隨著對CMS育性恢復機制研究深入，已經證明線粒體基因組中的開放閱讀框是造成不育的重要原因，但是利用這些開放閱讀框的特異性表達影響育性的研究還需更加深刻，因此，線粒體開放閱讀框在不育系構建上的應用也是將來需要研究的一個重要方面。此外，利用葉綠體表達載體轉化毒素基因構建不育系[57]的研究成功為今后對CMS的研究和應用開辟了新的思路。

（4）可以借助高通量測序技術，綜合各種組學研究，從全基因組、轉錄組、蛋白組、代謝組、表觀基因組、表形組等多個水平對植物CMS的分子機制進行全面深入的研究，為挖掘CMS候選基因以及深入解釋CMS的分子機制提供豐富的信息，加速對植物細胞質雄性不育和育性恢復調控機制的研究進程。