微環(huán)境對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自噬水平的影響研究進(jìn)展

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自噬是細(xì)胞的自我吞噬，通過俘獲或者降解聚集的蛋白、失調(diào)的細(xì)胞器來維持體內(nèi)平衡。自噬包含3種機(jī)制：微自噬、自我吞噬和大自噬[1]。自噬是通過俘獲擴(kuò)大的細(xì)胞膜內(nèi)細(xì)胞質(zhì)所含的靶物，最終圍繞成雙重的膜囊小泡，通過微管穿梭到溶酶體進(jìn)行消化和降解的過程[2-3]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種多能干細(xì)胞，來源豐富、易于培養(yǎng)，且在體外培養(yǎng)傳數(shù)代仍保持多向分化的特性，是治療疾病的理想種子細(xì)胞。大量文獻(xiàn)報道通過體外培養(yǎng)的BMSCs輸注到體內(nèi)后，具有修復(fù)與重建受損組織的功能[4]。BMSCs治療疾病的機(jī)制研究多從其影響體內(nèi)的炎癥因子、信號通路、基因、蛋白的表達(dá)等方面進(jìn)行，已取得了一定成果[5]。目前研究又發(fā)現(xiàn)BMSCs存在自噬，外界環(huán)境的干預(yù)可影響B(tài)MSCs的自噬水平，從而影響其功能的發(fā)揮，了解BMSCs的自噬有助于我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其治療機(jī)制。

1 缺氧對BMSCs自噬的影響

BMSCs的自噬與其所處環(huán)境中氧氣含量密切相關(guān)。有研究顯示在5%的氧氣條件下可激活BMSCs的細(xì)胞自噬來協(xié)同成骨分化誘導(dǎo)液促進(jìn)其向成骨分化，可能是通過抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、磷酯酰肌醇3激酶(phosphalyl inositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)等信號通路，促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生[6]。氧化應(yīng)激對BMSCs的存活具有雙重作用，在誘導(dǎo)BMSCs凋亡的同時還誘導(dǎo)保護(hù)性自噬作用，阻斷BMSCs的自噬可加速BMSCs的凋亡，增強(qiáng)BMSCs的自噬能夠提高其在糖尿病移植治療中的存活率[7]。在缺氧的條件下，白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6通過Akt-兔抗人信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transductor and activators of transcription 3，STAT3)通路提高BMSCs的自噬能力，從而提高抗缺血缺氧的能力，發(fā)揮對BMSCs的自我保護(hù)作用[8]。BMSCs可以誘導(dǎo)人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞自噬，并在缺氧的條件下改善其生存狀況，減少早期的凋亡[9]。BMSCs具有一定的抗缺氧能力，一定的缺氧環(huán)境可提高BMSCs的自噬水平，避免發(fā)生凋亡。

2 藥物對BMSCs自噬的影響

雷帕霉素是一種大環(huán)內(nèi)脂類免疫抑制劑，可用于免疫相關(guān)疾病與器官移植引起的排斥反應(yīng)治療[10]，可增加基礎(chǔ)自噬活性較低的BMSCs的自噬活性，減弱向成骨分化的潛能，自噬可能參與BMSCs向成骨分化的過程[11]。雷帕霉素還可誘導(dǎo)再生障礙性貧血患者的BMSCs發(fā)生自噬和凋亡，抑制細(xì)胞的增殖與降低成脂分化，其機(jī)制可能與雷帕霉素抑制mTOR信號通路而激活了自噬有關(guān)[12]。適度提高自噬活性可以增加BMSCs誘導(dǎo)后向神經(jīng)細(xì)胞分化的分化率，如10 μmol/L的雷帕霉素可誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化，誘導(dǎo)后BMSCs自噬水平增高，神經(jīng)元標(biāo)志蛋白微管相關(guān)蛋白-2(microtubule-associated protein,MAP-2)、Tau表達(dá)高于其他組(P<0.05)[13]。經(jīng)過雷帕霉素處理BMSCs后，還可促進(jìn)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)和MAP-2的表達(dá)(P<0.05)[14]。BMSCs可通過提高自身的自噬水平，來適應(yīng)復(fù)雜的生存環(huán)境，在研究Mncl2誘導(dǎo)人類支氣管上皮6HBE細(xì)胞發(fā)生死亡的實驗中，當(dāng)6HBE細(xì)胞暴露于Mncl2中，自噬吞噬泡和LC-3B-II的表達(dá)上升，自噬水平升高，其扮演一個保護(hù)性角色來對抗Mncl2誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[15]。具有抗菌、抗瘧作用的歐前胡素可提高內(nèi)源性BMSCs的自噬能力，恢復(fù)其向成骨分化的能力，治療雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松[16]。相反，環(huán)磷腺苷葡胺可以誘導(dǎo)BMSCs向心肌細(xì)胞分化，經(jīng)環(huán)磷腺苷葡胺處理后的自噬蛋白Beclin-1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)Ⅱ/Ⅰ比值下降(P<0.05)，說明其在一定程度上抑制了誘導(dǎo)后心肌細(xì)胞的自噬，可能與P13K/AKT/mTOR信號通路有關(guān)[17]。雷帕霉素、環(huán)磷酰胺均為免疫抑制劑，但是其誘導(dǎo)BMSCs產(chǎn)生自噬的結(jié)果相反，說明經(jīng)過特定的藥物可誘導(dǎo)BMSCs的自噬與凋亡，藥物用量是其中的關(guān)鍵。適當(dāng)劑量，可提高BMSCs自噬水平，抑制凋亡，當(dāng)超過某個劑量，則抑制自噬，促進(jìn)凋亡，對誘導(dǎo)藥物的劑量把握有待基礎(chǔ)做進(jìn)一步的研究。

3 輻射對BMSCs自噬的影響

BMSCs在經(jīng)過8 Gy X線照射2 h后，自噬相關(guān)基因LC3的mRNA表達(dá)增加，說明BMSCs經(jīng)照射后存在自噬的活化[18]。經(jīng)6 Gy X線照射聯(lián)合200 nmol/L的雷帕霉素組與照射組、雷帕霉素組相比，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組LC3-Ⅱ表達(dá)明顯升高[19]，說明經(jīng)過雷帕霉素處理聯(lián)合6 Gy X線照射可提高BMSCs的自噬水平。可見輻射可激活BMSCs的自噬，而自噬水平的提高對BMSCs具有放射性保護(hù)作用。

4 腫瘤微環(huán)境對BMSCs自噬的影響

當(dāng)BMSCs與多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)細(xì)胞共培養(yǎng)，BMSCs可以促進(jìn)MM細(xì)胞株XG-7細(xì)胞的增殖水平，其凋亡率對比單獨培養(yǎng)下降(P<0.01)，XG-7細(xì)胞單獨培養(yǎng)或者與BMSCs細(xì)胞共同培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下均出現(xiàn)了自噬，但是共同培養(yǎng)后XG-7細(xì)胞自噬現(xiàn)象相對少，說明BMSCs可以減少XG-7細(xì)胞的自噬，促進(jìn)其增殖[20]。有研究報道當(dāng)BMSCs與胃癌BCG-823細(xì)胞非接觸共培養(yǎng)后注射到裸鼠體內(nèi)，實驗組在第7天皮下出現(xiàn)結(jié)節(jié)，14天腫瘤結(jié)節(jié)增大，潛伏膜蛋白(latent membrane protein 1,LMP1)高表達(dá)，抑癌基因轉(zhuǎn)錄因子21(transcription factor 21，TCF21)低表達(dá)，說明經(jīng)過胃癌微環(huán)境轉(zhuǎn)化后的BMSCs具有體內(nèi)致瘤性[21]。BMSCs與人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251體外共培養(yǎng)后，通過檢測相關(guān)基因表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)人BMSCs在腦膠質(zhì)瘤的干預(yù)下可見現(xiàn)部分癌基因的高度表達(dá)[22]。Paunescu等[23]研究示BMSCs可以被招募到腫瘤，然后增殖并獲得腫瘤相關(guān)細(xì)胞表型，證明腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞起源于BMSCs，可能是BMSCs的一個亞群。由此，BMSCs與腫瘤細(xì)胞在一起培養(yǎng)，其本身不僅具有腫瘤細(xì)胞的生物特性，還可減輕腫瘤細(xì)胞的自噬，促進(jìn)增殖。BMSCs移植治療腫瘤相關(guān)的疾病受到了質(zhì)疑，需要進(jìn)一步探討。

5 其他因素對BMSCs自噬的影響

培養(yǎng)3代的BMSCs通過L-DMEM誘導(dǎo)后可向神經(jīng)細(xì)胞分化后，神經(jīng)元特異性標(biāo)志物NSE表達(dá)率為83%左右，LC3B、自噬蛋白Beclin1、Atg7、Atg5、Atg10表達(dá)水平升高，自噬標(biāo)志蛋白LC3B平均熒光輕度增高，自噬標(biāo)志蛋白LC3B-Ⅱ表達(dá)增高，說明經(jīng)L-DMEM誘導(dǎo)后的BMSCs自噬水平是升高的[24]。用50 μg/L的干擾素(interferon，IFN)-γ可誘導(dǎo)無血清培養(yǎng)人胎盤胎兒側(cè)來源的BMSCs向成骨細(xì)胞與脂肪分化，其能提高自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)，說明INF-γ誘導(dǎo)后的BMSCs自噬水平增高，可抑制人胎盤胎兒側(cè)來源的BMSCs增殖能力[25]。用50 ng/mL的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α在24 h內(nèi)可以激活牙周膜干細(xì)胞和頜骨BMSCs的自噬水平，其在短時間內(nèi)不導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[26]。BMSCs自噬水平也與其培養(yǎng)時間有關(guān)，有研究顯示BMSCs在體外可以誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，在誘導(dǎo)0.5 h后，自噬相關(guān)基因Beclin-1表達(dá)是增加的，1 h后逐漸降低[27]。還有研究顯示脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞衰老與其在體外培養(yǎng)的時間成正比[28]。由此，通過特定的方法誘導(dǎo)BMSCs向目的方向分化的過程中，其自噬水平是增高的，從而避免了凋亡的發(fā)生，誘導(dǎo)物用量的把握是關(guān)鍵。BMSCs的自噬水平與培養(yǎng)的時間具有一定的關(guān)聯(lián)，短時間內(nèi)可通過提高自噬水平避免發(fā)生凋亡，說明時間對BMSCs的活性也是雙向的調(diào)節(jié)作用。

BMSCs自噬是細(xì)胞通過自我降解來適應(yīng)復(fù)雜的外界環(huán)境、保持細(xì)胞活性的一種表現(xiàn)。自噬與其抗缺氧能力相關(guān)，在一定的缺氧條件下，可以誘發(fā)BMSCs的自噬，從而避免發(fā)生凋亡。在一些代謝性疾病的過程中，體內(nèi)會出現(xiàn)氧化應(yīng)激、糖的自氧化，可使得體內(nèi)產(chǎn)生過多活性氧，破壞體內(nèi)氧化和抗氧化平衡[29]，BMSCs的自噬及其抗缺氧特性為其移植治療一些代謝性疾病提供了理論參考。對于藥物、輻射誘導(dǎo)BMSCs的自噬提示，BMSCs的自噬是有限度的，在一定的藥物誘導(dǎo)，或者一定量的X線照射下，BMSCs可以通過提高自噬避免發(fā)生凋亡；當(dāng)超過一定量的情況下，其自噬水平是下降的，從而促使細(xì)胞自增，進(jìn)而發(fā)生凋亡，所以BMSCs的自噬對本身活性的調(diào)節(jié)作用是雙向的，而時間對BMSCs的活性調(diào)節(jié)也是雙向的。BMSCs在特定物質(zhì)的誘導(dǎo)下可以向目的方向分化，而選用誘導(dǎo)物的劑量為研究的關(guān)鍵。在生理狀態(tài)下，BMSCs具有自我更新與分化的潛能，與自噬密切相關(guān)[30]。自噬作為細(xì)胞的一種保護(hù)機(jī)制，其可以清除細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激受損的細(xì)胞器、代謝產(chǎn)物及蛋白，經(jīng)過溶酶體降解為氨基酸、甘油三酯等小分子物質(zhì)，供細(xì)胞的循環(huán)用，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，避免細(xì)胞進(jìn)一步的損傷[31]。自噬水平升高可提高BMSCs應(yīng)對氧化應(yīng)激的生存率，維持BMSCs的活性，抑制增殖[32]。而過度的自噬可導(dǎo)致自噬體在細(xì)胞內(nèi)堆積，形成自噬壓力，進(jìn)而引起細(xì)胞程序性死亡[33]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為人體發(fā)病的根本原因是機(jī)體陰陽平衡在體內(nèi)受外界因素的干擾下遭到破壞，從而出現(xiàn)一系列病理癥狀，這與BMSCs的自噬具有相似之處。中醫(yī)調(diào)節(jié)機(jī)體陰陽平衡的經(jīng)典方劑為左、右歸丸[34]，是不是左、右歸丸干預(yù)了自噬從而達(dá)到治療目的有待進(jìn)一步研究。另外，腫瘤細(xì)胞為一種無限增殖的惡性細(xì)胞，在中醫(yī)學(xué)上屬“陽”，在BMSCs的干預(yù)下，其可以降低腫瘤細(xì)胞的自噬，促進(jìn)增殖[35]，探尋一種抑制“陽”的藥物，也就是提高腫瘤細(xì)胞的自噬的藥物，是不是可以維持機(jī)體陰陽的平衡狀態(tài)及提高腫瘤患者的生存周期?BMSCs移植可否治療腫瘤相關(guān)疾病還需要進(jìn)一步研究。