Twist基因與食管癌關系的研究進展

趙榮榮，龔太乾

Twist 是位于常染色體上的編碼堿性螺旋-環-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)的轉錄因子，最初很多研究表明，Twist主要在果蠅的胚胎發育中起著關鍵調控作用，尤其在中胚層的形成和分化中起著重要作用[1]。而近年來越來越多的研究發現，Twist作為一種癌基因，與上皮-間質轉變(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及惡性腫瘤的生長、侵襲、轉移和細胞凋亡關系密切[2-5]。鑒于Twist在EMT及腫瘤的發生、侵襲、轉移和預后中都發揮著很重要的作用，Twist有望作為惡性腫瘤重要的診斷標志物和潛在的藥物治療靶點，并且還可作為預測患者預后的新指標。

雖然目前關于Twist與腫瘤的關系研究較多，但還未見文獻就Twist與食管癌的關系進行總結。作者就Twist與食管癌的發生發展的研究現狀作一綜述。

1 Twist簡介

Twist是位于常染色體上的基本的bHLH家族的轉錄因子，在胚胎發育中起重要作用[1]。在人類中Twist包含有2種，即Twist1和Twist2，它們編碼的蛋白都有相同的bHLH結構域，Twist1又常被稱為Twist[6]。Twist能夠識別短的DNA保守序列CANNTG，即E-box結構域。Twist在不同的種屬之間序列高度保守,在小鼠和人類的氨基酸序列具有96%的同源性，而其DNA結合區域更是具有100%的序列保守，它們都能結合一種E-box的DNA序列[7]。E-box存在于許多基因中，在不同類型的器官發育中，Twist通過轉錄因子調控方式抑制或活化下游基因，從而對器官的發育產生重要的調控作用。

人類的Twist基因位于7p21.2，包含2個外顯子和1個內含子。第一個外顯子包含1個ATG區域隨后是1個編碼202個氨基酸的開放閱讀框。開放閱讀框后是1個含有45 bp的不翻譯的外顯子區域，1個536 bp的內含子區及另一個不翻譯的外顯子區(65位和415位有2個潛在的聚腺苷酸位點)[7]。人類Twist的分子量大約為21 kDa，等電點為9.6。這個蛋白在臨近N端的區域包含著更有極性的氨基酸區域，而在C端即bHLH區域則沒有極性，所以Twist的N端比C端更有極性。人類Twist蛋白與鼠的Twist有著96%的同源序列。而果蠅有490個氨基酸序列的Twist，比人類、鼠、爪蟾的氨基酸序列都大。

2 Twist與EMT

EMT指上皮細胞失去了分化的特性，包括細胞與細胞之間的連接及上皮細胞的極性，而具有了間質細胞的特性，比如浸潤、游走和侵襲的能力。它是胚胎發育的一個基本過程，使得在特殊部位產生的上皮細胞從上皮組織中分離出來并遷移到其他位置，是正常發育、傷口愈合及惡性上皮腫瘤發生的基礎。E鈣黏蛋白(E-cadherin)的減少或丟失是EMT最重要的標志性變化。

Twist是一種bHLH轉錄因子，它已經被鑒定通過調控E-cadherin的表達在EMT誘導的轉移中起重要的作用。Gao等[8]研究了食管鱗癌中Twist的表達與食管癌EMT之間的相關性，并探索了Twist表達和腫瘤滲透性及轉移性之間的關系。研究表明Twist與Vimentin在食管癌，尤其是轉移的食管癌中過表達，而E-cadherin在食管鱗癌中的表達則下調，初步表明Twist通過下調E-cadherin作為腫瘤侵襲和轉移的啟動子。Lee等[9]于2012年用免疫組化和反轉錄聚合酶鏈反應檢測了199例食管癌樣本中Twist的表達，并用組織樣本和體外模型分析了Twist和食管癌EMT之間的相關性，結果表明Twist與食管癌的EMT顯著相關，并且有可能作為食管癌診斷和預后的分子標志物。Sasaki等[10]在食管鱗癌的患者中檢測Twist和E-cadherin的表達以及它們的預后價值，結果發現Twist的高表達和E-cadherin的低表達與腫瘤侵襲的深度、淋巴結轉移、遠程的節點轉移、臨床分期以及預后差顯著相關，并且Twist的高表達與E-cadherin的低表達顯著相關。目前還有很多研究發現在食管鱗癌中Twist蛋白的表達與E-cadherin的表達呈顯著負相關，提示Twist蛋白可能通過上游調控造成E-cadherin表達降低或缺失是發生EMT的關鍵機制,從而增強腫瘤細胞的侵襲力和轉移力[11-13]。

3 Twist與食管癌血管生成

近年來對腫瘤血管生成的研究表明，血管生成在腫瘤的生長、惡化和轉移等方面起著很重要的作用。血管表皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)作為最重要的血管內皮生長因子之一，可以促進血管內皮細胞的增殖，增強血管的通透性，還可以介導內皮細胞的浸潤和遷移。在大多數惡性腫瘤中，VEGF的表達均升高，并且誘導腫瘤血管的生成。趙杰等[14]研究發現在食管鱗癌臨床組織樣本中Twist與VEGF的表達成正相關，提示Twist蛋白可能通過VEGF介導腫瘤血管生成，在食管鱗癌的生長、轉移等方面發揮重要作用。Gong等[15]的研究進一步驗證了食管鱗癌的臨床組織樣本中Twist與VEGF-C共表達,并且發現過表達Twist后食管鱗癌細胞的侵襲能力和VEGF-C的表達上調。這項研究表明Twist在食管鱗癌的淋巴結轉移中通過增強VEGF-C的表達從而促進淋巴結轉移。然而關于Twist與食管癌的血管生成的更直接的證據目前還沒有相關文獻報道，現有的關于Twist與血管生成的直接證據在肝癌及乳腺癌中均有過相關研究，研究發現上調Twist表達后可以提高腫瘤血管流量和血管滲透性[16]。

4 Twist與食管癌的浸潤和轉移

腫瘤的轉移是一個較為復雜的過程，在此過程中需要不同的基因和信號通路來參與調控。目前腫瘤的轉移包括如下幾個步驟:①腫瘤細胞從原發性腫瘤病灶中分離，在此步驟中細胞需要經歷EMT來獲得分離的能力；②侵入周圍組織，穿透基底膜，進入血管或者淋巴管，各種蛋白溶解酶和趨化因子起著關鍵作用；③在失巢凋亡情況下存活；④移出或滲出血管或淋巴管；⑤形成微型轉移結節；⑥適應周圍基質環境，經過EMT重新獲得上皮細胞增殖特性，形成轉移灶。

目前很多研究表明Twist在食管癌的浸潤和轉移中起著重要作用。Gong等[15]研究發現細胞核中Twist的表達與食管癌的淋巴結轉移緊密相關。首先通過免疫組化檢測發現Twist在轉移的食管鱗癌組織中的表達要顯著高于非轉移的食管鱗癌組織，其次在建立的高轉移的食管鱗癌細胞系中檢測到Twist高表達。研究表明Twist可以促進食管癌的淋巴結轉移。賀波等[17]采用免疫組化染色方法檢測Twist在58例食管癌及對應癌旁組織表達情況，并分析其細胞亞定位與患者性別、年齡、腫瘤位置、TNM分期、淋巴結轉移等臨床資料的關系。結果表明Twist在食管癌細胞漿及細胞核中表達水平均顯著高于癌旁組織(P<0.01),Twist在食管癌細胞核中的高表達與患者TNM分期及淋巴結轉移密切相關(P<0.01)，而與患者性別、年齡及食管癌位置無顯著相關性(P>0.05)。目前還有很多研究分析了Twist的表達與食管鱗癌臨床病理資料之間的相關性，發現Twist的表達與食管鱗癌的臨床分期、淋巴結轉移及腫瘤的浸潤深度均顯著相關，這些發現進一步驗證了Twist參與了食管癌的浸潤和轉移[12，14,18-20]。

5 Twist與食管癌的細胞凋亡

腫瘤作為一種細胞周期異常疾病，具有增殖失控和凋亡抑制的基本特征。相關研究表明Twist通過抑制p300/CBP相關因子(p300/CBP-associated factor，PCAF)來調控p53轉錄活性，使p53失去調控細胞凋亡的功能，從而促進腫瘤及腫瘤血管生長等生物學功能[7,21]。另外Twist還可通過改變成纖維細胞的特性，抑制可變讀框基因(alterative reading frame，ARF)/雙微體(murine double mimute2，MDM2)/p53，增強抗細胞凋亡作用。研究發現Twist對p53途徑的作用主要表現在轉錄和翻譯兩個層次[7,21-22]。Twist抑制ARF的表達影響p53穩定性以及抑制p53分子結構中20位的絲氨酸(Ser20)的自身磷酸化，從而使p53介導的細胞凋亡途徑失活；另外通過與p53反式作用因子HOXA5的相互作用，減少p53對Twist轉錄活性的抑制作用；同時Twist還通過抑制p300介導的乙酰化，阻止p53、p300和MDM2形成三元絡合物，間接抑制p53介導的基因轉錄。有相關研究還表明Twist可以綁定p53 C-末端來阻滯p53轉錄后調控及MDM2介導的降解，發揮促進腫瘤進展的重要作用[22]。

目前有相關研究通過檢測食管癌患者的癌組織、癌旁組織和正常食管組織中Twist、p53、E-cadherin蛋白表達水平,探討了Twist蛋白表達與食管癌臨床病理參數的關系，并分析了Twist與p53、E-cadherin蛋白表達的相關性[23]。結果表明食管癌組織中p53表達水平顯著高于癌旁組織和正常食管組織,并且在不同的浸潤深度、TNM分期、腫瘤分化程度和有無淋巴結轉移的食管癌組織中p53蛋白表達具有顯著差異,同時發現食管癌組織中Twist表達水平與p53之間存在明顯的正相關性,表明食管癌中Twist可能通過誘導p53基因突變,使其失去抗癌作用從而參與食管癌的發生和發展,同時可能通過其他p53非依賴性通路抑制細胞的凋亡。這項研究表明Twist可能通過調節ARF/p53途徑抑制細胞凋亡促進腫瘤細胞形成,同時影響E-cadherin的表達而促進EMT現象,參與食管癌的發生和轉移。

6 Twist與食管癌的預后

Twist被認為是腫瘤細胞中促進轉移和誘導EMT的關鍵因子。在很多腫瘤中都報道過Twist參與了腫瘤的進展和轉移，然而關于Twist和腫瘤預后的相關性卻仍舊存在爭論。Wushou等[24]用系統回顧和Meta分析法來鑒定Twist的表達是否和腫瘤患者的預后存在相關性。這個研究包含了17個實驗：肺癌4個、頭頸癌3個、乳腺癌2個、食管癌2個、肝癌2個、骨肉瘤，膀胱癌，宮頸癌和卵巢癌各1個，共2 006例患者。結果表明Twist的表達與3年和5年生存率較差相關，與Twist的表達和腫瘤預后較差相關。另外Sasaki等[10]在166例食管鱗癌患者原發腫瘤外科手術樣本中用免疫組化檢測了Twist的表達和臨床病理資料及預后的關系，研究發現Twist高表達和低表達組5年生存率有顯著差異，同樣的高表達E-cadherin組和低表達E-cadherin組5年生存率也有顯著差異，并且高表達Twist和低表達E-cadherin的5年生存率要比低表達Twist高表達E-cadherin組的5年生存率要差。目前有很多研究表明Twist可以作為食管癌預后的分子標志物[25-27]。

7 展望

Twist作為一種重要的促癌基因，與食管癌的發生、浸潤、轉移以及預后密切相關。但目前關于Twist調控食管鱗癌淋巴轉移的分子機制以及Twist相關的信號通路都還不清楚，不過隨著Twist與腫瘤關系的研究這些問題終將得到解決。鑒于Twist在食管癌侵襲和轉移過程中的特定作用，我們可以通過靶向Twist從而阻止食管癌浸潤的發生及轉移灶的形成，為患者治療提供新的理論依據。