循環腫瘤細胞檢測在晚期腫瘤患者維持治療中的應用

連潔，楊宇

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院腫瘤內科，哈爾濱 150001)

近年來，惡性腫瘤的發病率和死亡率呈逐年上升的趨勢，成為威脅人類生命的重要原因之一。由于大多數晚期惡性腫瘤具有難以治愈的特點，臨床治療目標為改善生活質量、延緩腫瘤進展以及延長生存時間。“維持治療”理念的提出正是契合了這樣的診療現狀和需要。2003年美國臨床腫瘤學會指南中指出，一線誘導化療方案不宜>6個周期。6個周期后繼續使用該方案不但不能延長患者生存時間，反而易造成毒性積累以及生存質量的下降[1]。因此，行一線治療4～6周期后達到最大緩解療效但仍不能行手術切除的患者，將進入維持治療階段，直至疾病出現復發及進展時再行二線治療。如果能及時評價維持治療療效，就能針對患者選擇最優治療方案，以延長患者生存期。但如何精準確定終止維持治療的時機目前尚無統一標準，臨床上通常使用腫瘤標志物、影像學檢查及患者臨床表現來評估腫瘤進展，進而更換二線治療方案。及早預測及判斷維持治療期間疾病進展，及時更換治療方案，對于延長晚期腫瘤患者生存期有重要意義。

近年來，循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTC)以其良好的敏感性、特異性、創傷小、取材方便及可重復性，受到臨床醫師的青睞。CTC是指由實體瘤或轉移灶脫落進入血液循環的腫瘤細胞，是腫瘤患者出現術后復發和遠處轉移的重要原因[2]。CTC在腫瘤診斷、病程分期、預測疾病進展及評估化療療效等方面的作用已經得到驗證。那么維持治療期間使用CTC檢測，是否可以更早地預測及判斷疾病進展，從而精準確定開始二線治療的時機？本文就此問題作以下綜述。

1 CTC的提取分離和檢測方法

CTC主要有2大類分離技術，分別是形態學方法和抗原抗體方法。形態學方法分為過濾法和梯度離心法。過濾法的原理是根據腫瘤細胞的體積大于白細胞體積分離CTC。梯度離心法是根據腫瘤細胞與白細胞密度不同，通過梯度離心分離CTC。抗原抗體方法分為陽性捕獲法(免疫磁性分離)、陰性富集法(免疫磁性分離)以及負向篩選法。陽性捕獲法的原理是采用抗上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)結合免疫磁珠捕獲EpCAM陽性CTC。陰性富集法的原理是利用CD45磁珠抗體吸附白細胞，在磁場作用下去除白細胞，CTC被富集沉淀。負向篩選是基于免疫磁珠技術的富集原理，采用去除血液中腫瘤細胞之外的其他干擾成分(紅細胞、白細胞、血漿蛋白等)的實驗方法，達到富集CTC目的。此方法不依賴于腫瘤細胞大小及特異性抗原，所有種類的CTC、循環腫瘤微栓子(circulating tumour microemboli,CTM)等異常細胞都會被富集，是一種理想的CTC富集技術，異常細胞回收率高，可去除>99.99%的白細胞，腫瘤細胞回收率>80%，為進一步鑒定提供技術保障。

CTC的檢測方法主要有實時熒光定量PCR[3]方法、微型芯片技術[4]和單細胞測序技術。其中單細胞測序技術為第3代檢測技術。第3代測序技術不需要PCR擴增即可直接對單個分子進行測序；樣品制備簡單，測序成本進一步降低；可直接讀取RNA的序列和包括甲基化在內的DNA修飾。這些優勢可大大改善臨床基因測序的成本、速度和質量等。Leung等[5]研究發現，1例患者通過單細胞測序發現腫瘤細胞在肝轉移前出現大量突變，而且肝轉移病灶惡性程度很高。在另一例患者的CTC和單細胞測序結果中，發現腫瘤細胞具有多克隆的種子，其中肝轉移的2個克隆細胞與原發灶基因圖譜完全不同，單個細胞的數據亦揭示了獨立的腫瘤基因譜系；另外，數據還揭示了2例結直腸癌(colorectal cancer,CRC)患者轉移的晚期傳播模型，但當前CTC在檢測方法上仍存在一定不足，需要更多大型的前瞻性試驗研究。

2 CTC的臨床應用

2.1 CTC與腫瘤早期診斷

受限于CTC的提取方法，以往的研究認為，只有晚期腫瘤患者才可以檢測CTC。Jin等[6]在早期肺腺癌患者血液中檢測到了CTC的存在，Chen等[7]亦研究了CTC對肺癌早期診斷的意義。

在腫瘤細胞中，Ki67指數是細胞增殖的生物標志物。有研究認為，CTC計數和Ki67指數具有潛在診斷CRC的價值。Yang等[8]在2017年研究中共納入105例CRC手術患者，分別進行CTC計數和Ki67的表達免疫組織化學檢查。結果發現，CTC計數和Ki67指數可作為CRC診斷的生物標志物，且獨立于患者的性別、年齡、腫瘤大小和部位及腫瘤進展。有趣的是，Ki67指數被證明與腫瘤分化呈負相關。此外，CTC計數亦可作為CRC一種轉移性相關的生物標志物，獨立于Ki67指數。因此，使用CTC可對易感人群進行篩查，從而及早發現腫瘤的存在，以達到早期診斷、早期治療的目的。

2.2 CTC與腫瘤分期

CTC高表達于部分腫瘤分期較早的腫瘤患者外周血中，可導致腫瘤的快速轉移和復發，且CTC數值與腫瘤分期相關[9]。Sastre等[10]將每7.5 ml 外周血中≥2個CTC定為陽性，通過檢測外周血中CTC的數量，發現CTC陽性率與結腸癌分期相關。

2.3 CTC與腫瘤個體化醫療

CTC可用于檢測腫瘤治療相關的基因突變或蛋白，獲取患者基因信息，從而指導患者個體化治療[11]。隨著基因檢測技術迅速發展，人們發現針對靶向基因的藥物可獲得很好的療效。Maheswaran等[11]在接受吉非替尼治療的非小細胞肺癌患者CTC中，檢測到表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)T790M突變，且結果與腫瘤組織檢測保持一致。He等[12]分別檢測了CTC、循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA,CTDNA)以及組織活檢中EGFR突變的情況，得到95%的一致率。可見在難以獲得病理標本的患者中，可考慮利用CTC檢測替代組織活檢判斷患者基因突變情況。但受限于CTC分離等技術上的難題，目前臨床上仍未廣泛應用CTC來指導靶向治療。

2.4 CTC與腫瘤預后

CTC是一種反應腫瘤負荷的獨立指標。研究顯示，觀察患者治療前及治療過程中外周血CTC數目的變化，有助于評估腫瘤進展及藥物治療療效。有研究發現[13]，在非轉移性三陰性乳腺癌患者中，每7.5 ml血液中CTC>2個的患者無進展生存期和總生存期較CTC<2個者短。Rahbari等[14]研究發現，CRC患者的預后與CTC數量有關。CTC數量越多，患者5年生存率越低，預后越差。另有研究表明，檢測CTC可預測轉移性前列腺癌的總生存期以及多西他賽的治療效果[15]。因此，檢測CTC的數量多少并記錄化療前后的數量變化，可反映腫瘤的預后及化療療效。

3 維持治療期間CTC的應用

維持治療作為由一線到二線的過渡治療，其益處已經得到廣泛的認可。維持治療的停藥指征為出現疾病進展或不可耐受的不良反應。盡早發現維持治療期間的疾病進展以便調整治療方案，可改善并延緩病情進展。臨床醫師大多利用腫瘤標志物、影像學檢查的實體瘤療效評價標準(1.1版)[16]及患者臨床表現來評估腫瘤進展，以判斷終止維持治療的時機。這種方法有一定局限性。(1)腫瘤標志物只能用于協助判斷；(2)局部的影像學檢查不能完全判斷全身情況；(3)臨床表現有極大的主觀性。因而使用以上方法不能及時地反映腫瘤進展。在這種情況下，是否會錯誤判斷維持治療的終點，從而延誤開始二線化療的時機呢？研究者開始嘗試其他檢測腫瘤進展的方法。近年來研究發現CTC可以比影像學檢查更早發現化療過程中出現的疾病進展[17]。

研究者針對人EGFR2陰性的胃癌患者，制定了貝伐單抗、卡培他濱、奧沙利鉑及多西他賽聯合治療6周期后，再用卡培他濱聯合貝伐單抗維持治療的方案。其結果為，CTC陽性(CTC≥2個)患者無進展生存期 7.9個月，CTC陰性患者14.4個月；總生存期分別為10.2個月和21.5個月[18]。另有研究者對Ⅳ期黑色素瘤使用生物化學治療(順鉑、達卡巴嗪、長春新堿、干擾素、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子)及生物化學維持治療(白細胞介素-2和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子)，并應用CTC判斷療效[19]。以上2項試驗證實了使用CTC判斷維持治療療效的可行性。

總之，在維持治療期間盡早發現疾病進展，及早使用二線化療，可提高患者生存期。如前文所述，CTC檢測作為腫瘤患者化療療效的動態監測手段已經為人們認可。盡管還沒有試驗直接驗證CTC檢測在維持治療中的應用，但是基于CTC在判斷化療療效、預測疾病進展等方面的優勢，考慮利用CTC檢測比現有檢測方法能更早、更準確地判斷終止維持治療并開始二線治療的時機。這一點有待更多臨床研究的證實。

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