HIV病毒庫清除策略研究進展

張和倩，常文仙，焦艷梅，張紀元，王福生

·導向與述評·

HIV病毒庫清除策略研究進展

張和倩，常文仙，焦艷梅，張紀元，王福生

HIV病毒庫的長期存在是HIV患者持續感染和難以徹底治愈的重要原因。目前以高效抗反轉錄病毒療法為核心的治療手段還難以將病毒庫徹底清除。研究證實HIV病毒庫存在于多種類型的CD4+T細胞內，包括中心記憶CD4+T細胞、CCR4+CCR6+和CXCR3+CCR6+CD4+T細胞、干細胞樣記憶CD4+T細胞、Vγ9Vδ2 T細胞及近期證實的濾泡輔助性T細胞等，而且有研究發現巨噬細胞、B細胞中也可能存在病毒庫。當前HIV病毒庫清除的策略主要有CCR5基因缺陷造血干細胞移植，基因編輯及激活然后殺死等，但這些方法仍然不能有效清除HIV病毒庫。最新研究發現HIV潛伏的CD4+T細胞表面CD32a分子特異性高表達，這為病毒庫的清除帶來新的希望。本文旨在綜述可能存在HIV病毒庫的免疫細胞及HIV病毒庫清除策略的研究進展。

HIV病毒庫；免疫細胞；清除策略

1997年，Chun等[1]首次發現HIV存在于CD4+T細胞中，并以一種前病毒形式整合在其中形成病毒庫。正是因為病毒庫的持續穩定存在，使得艾滋病治愈仍是醫學難題。在治療方面，蛋白酶抑制劑的廣泛應用極大地降低了艾滋病病死率[2]。1997年，有研究者采用蛋白酶抑制劑聯合2種核苷類似物治療艾滋病患者，該類患者血漿病毒載量顯著降低至不可檢測水平。強有力的新非核苷類反轉錄酶抑制劑（non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors,NNRTI）也得到了發展并應用于艾滋病的治療[3]，3種或更多的抗反轉錄病毒藥物的不同組合會對HIV的復制產生持久的抑制作用，這種治療HIV感染的方法被稱為高效抗反轉錄病毒治療（highly active antiretroviral therapy,HAART）。HAART可以控制患者病情，使其血漿病毒載量下降到檢測不到水平，在一定程度上實現免疫重建，極大地改善HIV感染者的生活質量，但仍不能徹底清除病毒庫。完整的HIV基因組整合在靜息CD4+T細胞中以前病毒形式穩定存在，很少表達甚至不表達病毒RNA和病毒蛋白[4-5]，HAART只能清除活躍復制的病毒，而潛伏的病毒由于缺乏蛋白表達不能被免疫系統及HAART清除，在停止治療2～3周后又會再度進行復制。病毒可以在這些細胞內潛伏數十年，一旦宿主細胞被激活，它們就可以產生感染性的病毒顆粒。病毒庫在感染早期就已形成并且其半衰期達44個月，而要想通過HAART完全清除HIV，須要連續抗病毒治療60～80年[6]。因此，清除病毒庫是艾滋病治愈的一大難題，想要通過清除病毒庫治愈艾滋病必須明確HIV病毒庫的潛伏感染細胞。本文對病毒庫所潛伏的免疫細胞進行具體分析，并對近年一些病毒庫清除策略進行總結。

1 HIV病毒庫的定義及形成機制

病毒庫是HIV在細胞或組織器官的聚集，這些病毒須同時具有復制能力和穩定性。有缺陷的HIV基因序列或衰退的病毒顆粒（不具有復制能力），可被機體免疫系統清除的感染細胞，HAART可清除的病毒，表面蛋白gp120和gp41，分離及活躍復制的HIV均不屬于病毒庫[7]。目前研究認為，已確定的HIV潛伏及維持的機制主要包括：①宿主缺乏轉錄因子；②HIV DNA在宿主內異常整合位點阻礙轉錄；③轉錄在宿主細胞核內停滯；④表觀遺傳特征導致轉錄沉默；⑤病毒完整序列不完全轉錄；⑥miRNA 對病毒蛋白翻譯的限制等。多重互補機制導致HIV在靜息CD4+T細胞中長期潛伏。HIV持續存在和潛伏感染主要是由于HIV長末端重復序列（long terminal repeat,LTR）啟動子存在于抑制性環境中，導致HIV前病毒DNA轉錄水平受到抑制。這種抑制性環境包括：組蛋白乙酰酶和其他調節蛋白活性的激活；病毒轉錄宿主因子的缺失，如核因子κB和轉錄延伸因子b[8-9]。

2 病毒庫檢測方法

艾滋病患者經HAART后，血漿病毒載量基本檢測不到，但靜息CD4+T細胞中仍然潛伏少量的整合的HIV DNA，形成HIV病毒庫，這是HIV清除的主要障礙。病毒庫很小，每106個CD4+T細胞僅有1～10個感染HIV，形成病毒庫[10]。所以，提高檢測的敏感性和精確性，有助于識別潛伏HIV病毒庫的特征并采取干預措施進行清除[10]。目前，通過檢測HIV DNA和RNA尋找病毒庫的方法主要有5種。①定量病毒生長測定法（quantitative viral outgrowth assay,Q-VOA）是病毒庫檢測的金標準。該方法通過定量可被誘導的并有復制能力的HIV DNA檢測病毒庫，但該法需血量為120～180 ml，勞動強度大，耗時長，測試成本高[11]。②應用較廣泛的檢測方法是實時定量 PCR（quantitative real-time PCR,qPCR）。 在DNA擴增反應過程中，以熒光化學物質檢測每次PCR循環后產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析，須采用熒光染料，對引物要求高。③液滴數字PCR是一種精確度和靈敏度都高于qPCR的病毒庫檢測方法，通過在熱穩定性油中乳化水性PCR反應實現微分區。這種方法的優勢在于可以精確定量基因拷貝數變異情況[12]。④TZA是一種較新的HIV病毒庫檢測方法，主要利用TZM-bl細胞系，這種細胞穩定表達CD4、CCR5和CXCR4受體，并且在HIV LTR啟動子控制下攜帶整合的β-gal基因。細胞系可以量化誘導靜息CD4+T細胞中具有復制能力的HIV。這種方法靈敏度高，需血量少，勞動強度小，測試成本低[13]。對HIV潛伏量檢測比Q-VOA檢測估量高出多達70倍。⑤目前一種最新的檢測方法是用潛伏感染激活劑（latencyreversing agents,LRA）誘導HIV病毒庫活化，通過熒光原位雜交檢測HIVgag-polmRNA，同時檢測HIV Gag蛋白。這種方法檢測靈敏度比單獨檢測 HIV Gag蛋白高1000倍[14]。

3 病毒庫在免疫細胞中的分布情況

3.1 病毒庫在CD4+T細胞中的分布 患者經HAART后，血漿中的病毒載量下降至檢測不到水平，活躍復制的感染細胞被清除，最后只剩少量的潛伏HIV病毒庫的感染細胞，CD4+T細胞是HIV潛伏的主要場所。根據細胞表面CD45RA、CCR7和CD27表達情況將記憶細胞分類，中心記憶CD4+T細胞（central memory T cells,TCM）（CD45RA?CCR7+CD27+）和轉移記憶 CD4+T 細胞（transfer memory T cells,TTM）（CD45RA?CCR7?CD27+）被認為是主要的病毒庫[15]。將記憶CD4+T細胞按CXCR5、PD-1和Bcl-6歸類，認為CXCR5+PD-1+Bcl-6+亞群對應的主要是濾泡輔助性T細胞（follicular helper T cell,Tfh），在所有的CD4+T細胞中Tfh包含的HIV DNA最多，體外實驗證實Tfh內的HIV可以進行高效復制感染[16]。Tfh是HIV持續感染及潛伏的重要靶標，并成為HIV功能性治愈的主要障礙[17]。近期，有研究表明一種低分化具有很強自我更新能力的長壽命細胞——干細胞樣記憶T細胞，也被認為是病毒庫存在的主要位置[18]。此外，分別表達CCR6和CCR3的Th17和Th1Th17 CD4+T細胞也具有儲存病毒庫的能力[19]。有研究認為外周Vγ9Vδ2 T細胞也是HIV潛伏感染的病毒庫[20]。

CD4+T細胞是HIV潛伏的主要場所，經HAART后，CD4+T細胞幾個不同亞群中穩定存在著具有復制能力的HIV。幼稚CD4+T細胞是一類平均壽命1～8年的長壽命病毒庫，記憶CD4+T細胞是一類平均半衰期為1～12個月的短壽命病毒庫[16，21]，在接受HAART的患者體內，大多數前HIV DNA存在于記憶CD4+T細胞，其次才是幼稚或效應CD4+T細胞亞群[22]。根據細胞表面CD45RA、CCR7和CD27的表達情況，將CD4+T細胞分為幼稚T細胞（naive T cells,TN）（CD45RA+CCR7+CD27+）、TCM、效應記憶T細胞（effect memory T cells,TEM）（CD45RA-CCR7-CD27-）、TTM。HIV病毒庫在各類細胞分布情況為TCM占51.7%，TTM占34.3%，TEM占13.9%，TN僅占1.9%。實驗證實這些整合HIV前病毒的細胞被激活后可以產生感染性的病毒顆粒。以上數據表明TCM中穩定并持續存在HIV，這與它極低的增殖率及較長的半衰期有很大關系[16]。相較而言，TTM具有較低的病毒載量。

有研究者根據CD4+T細胞表型表達將其分為CCR4+CCR6+、CCR4+CCR6-、CXCR3+CCR6+及CXCR3+CCR6-T細胞，通過表達細胞因子和轉移因子分別識別 Th17、Th2、Th1Th17和Th1。在體外實驗中，CCR4+CCR6+和 CXCR3+CCR6+表達CCR5和CXCR4復合受體，允許R5和X4型HIV復制，而CCR4+CCR6-T細胞表達CXCR4僅允許X4型HIV復制，CXCR3+CCR6-T細胞表達CCR5和CXCR4，卻抑制R5和X4型HIV表達。在未經治療的HIV感染者中，總的CCR6+T細胞相較于CCR6-T細胞可以儲存更多的整合前HIV DNA。在抗病毒治療的慢性HIV感染者體內，總的CCR6+T細胞、CCR4+CCR6+T細胞和CXCR3+CCR6+T細胞均有下降。因此，研究者認為外周血中CCR4+CCR6+和CXCR3+CCR6+T細胞中存在大量HIV[19]。

干細胞樣記憶T細胞被認為是一個重要病毒庫。干細胞樣記憶T細胞是低分化記憶T細胞群，是通過表達CD45RA、CCR7、CD27和CD62L定義的，具有分化成不同TCM、TEM、終末分化T細胞的能力及自我更新的能力。增殖和自我更新的潛能使干細胞樣記憶T細胞能相對的抵消細胞凋亡，因此提供了一個穩定的長期存在的細胞群[18]。

外周 Vγ9Vδ2 T細胞被認為是HIV潛伏感染的病毒庫。研究者通過檢測18例經長期抗病毒治療患者的DNA序列，從14例患者體內純化出Vγ9Vδ2 T細胞，并發現具有復制能力的HIV，據此認為外周 Vγ9Vδ2 T細胞可能是一個沒有被發現的潛伏病毒庫[20]。

將記憶CD4+T細胞按CXCR5、PD-1和Bcl-6表型歸類，有CXCR5+PD-1+Bcl-6+、CXCR5-PD-1-Bcl-6-、 CXCR5+PD-1-Bcl-6-、CXCR5-PD-1+Bcl-6-和 CXCR5+PD-1+Bcl-6+幾種表達，CXCR5+PD-1+Bcl-6+T細胞亞群對應的是Tfh，因為病毒主要存在于Tfh中，Tfh和CXCR5-PD-1+細胞群是HIV特異性分布的主要CD4+T細胞亞群，并且在HIV感染的患者中Tfh和CXCR5-PD-1+細胞亞群相較于健康人比例明顯增高。CD4+T細胞中Tfh亞群攜帶HIV DNA的比例最高，該類細胞也是體外最有效的具有活躍復制能力的感染細胞，具有復制能力的病毒很容易從一些非進展期和低病毒載量（＜1000 copies/ml）患者Tfh內分離獲得[23]。在慢性無臨床癥狀的HIV-1感染者體內，HIV RNA在生發中心Tfh的頻率比在非生發中心Tfh頻率高。分離HIV感染者的淋巴結后發現，CXCR5+CD4+T細胞群儲存的HIV RNA是CXCR5-CD4+T細胞群的11～66倍[24]。

3.2 巨噬細胞作為潛在的病毒庫

HIV也可感染巨噬細胞，通過對人源性骨髓瘤小鼠進行實驗，Honeycutt等[25]研究發現HAART可以很快抑制巨噬細胞中的HIV，表現為血漿病毒載量迅速下降，治療停止7周，67%的小鼠未出現病毒反彈，在這些動物的組織巨噬細胞中未獲得有復制能力的病毒。但是，在其余的動物體內觀察到了病毒存在，并且延遲反彈與組織巨噬細胞持續感染的建立是一致的。這些觀察結果成為首次表明體內巨噬細胞中HIV持續存在的直接證據。然而缺乏輔助蛋白Vpx的HIV-2/猴免疫缺陷病毒在巨噬細胞中的復制能力是相當低。研究表明Vpx能解除宿主細胞中SAMHD1的限制，而后者能通過消耗體內的DNA阻止HIV基因的反轉錄[26-27]。因此在Vpx存在的情況下，巨噬細胞可能是一個主要的病毒庫[28-29]。研究證實，盡管人類HIV的Vpx的表達缺乏，但HIV仍然可以在人單核細胞源性巨噬細胞中復制，也可在人類扁桃體組織及陰道黏膜外植體中復制。巨噬細胞作為病毒庫一直處于爭論中，髓系細胞中大多數HIV DNA表現出的是重排T細胞受體序列，表明髓系細胞中的病毒DNA主要還是通過吞噬感染的T細胞獲得[30]。

有研究者利用人源性小鼠證實，即使經HAART后，在小鼠成熟的巨噬細胞中仍然能檢測到HIV的DNA和RNA，這些證據說明成熟的巨噬細胞可能是潛在的病毒庫[31]。

Bim是巨噬細胞線粒體內的一種促凋亡的負性調控因子。通過分析促凋亡和抗凋亡途徑，發現在HIV感染的巨噬細胞內Bcl-2、Mcl-1、Bak、Bax或caspase都沒有明顯的變化，而Bim表達上調并進入線粒體內。實驗結果表明，Bim可能是巨噬細胞作為HIV病毒庫抑制細胞凋亡的新機制，或者說進入線粒體的Bim可以作為病毒庫的標志物[32]。

3.3 B細胞作為潛在的病毒庫 激活的B細胞可能作為潛在的病毒庫。有研究證實CD40可介導B細胞表面CD4和CXCR4受體的表達，使B細胞更易感染HIV，成為潛在病毒庫[33]。

以上是國內外近年關于病毒庫在不同類型細胞類型中分布的研究結果（圖1），是否存在于其他類型細胞有待進一步研究。

圖1 HIV在免疫細胞中的分布情況Figure 1 Distribution of HIV in immune cells

4 病毒庫清除策略

4.1 CCR5基因缺陷造血干細胞移植 CCR5基因缺陷造血干細胞移植可能是一種有效的方法，通過強大的清髓療法將感染和未感染的細胞一起清除，將具有HIV抵制功能的人造血干細胞（表達CCR5受體基因缺陷）移植給患者，使患者的免疫系統重新注入具有HIV抵制功能的成熟細胞，“柏林病人”就是一個成功案例。在2次骨髓移植后成功治愈了白血病并且檢測不到HIV，供者是CCR5Δ32純合子基因型[34-35]?！鞍亓植∪恕睕]有清髓，也沒有出現移植物抗宿主反應，很可能是因為這些治療讓“柏林病人”產生了長期的藥物性病毒控制，或者是一個功能性治愈，而不是HIV病毒庫的徹底清除[36]。但這種方法潛在的風險、高額費用以及治療相關的后續問題使絕大多數HIV感染者放棄選用此方法并尋求相對安全的方法。目前對骨髓移植方面缺乏關注和研究，仍存在一定的治療風險。

4.2 基因編輯 減少潛在的病毒庫最直接的方法是使沒有表達的潛伏病毒庫永久的失活。近年，一些關于基因編輯的方法可以實現這一目標。基因編輯手段主要包括使用工程核酸酶如鋅指核酸酶、TAL效應器核酸酶或短回文重復序列等，它們可以阻斷細胞系或活化的原代細胞中的HIV前病毒。但將這些方法應用于體內靜息T細胞時卻面臨很多挑戰，包括如何在靜息CD4+T細胞中表達可以編碼編輯酶的外顯型DNA或RNA。遞呈有效量的具有治療功能的蛋白質進入靜息CD4+T細胞并產生作用是一個難題。納米粒子介導的遞送系統可以在體內遞送過程中對治療性的DNA、RNA、蛋白質起保護性作用，并幫助它們穿過質膜進入細胞[38-39]。工程化T細胞受體或嵌合抗原受體療法（chimeric antigen receptor,CAR）對某些腫瘤的治療效果顯著。目前也有一些科研人員針對HIV開發CAR-T細胞技術，利用類似的方法修飾免疫細胞達到清除病毒庫的目的[39]。

直接編碼潛伏的HIV基因還存在另一個難題，潛伏的前病毒可以整合在染色體DNA不能接近的區域，這就可以讓HIV免于DNA編輯酶的作用，例如，HIV前病毒整合在異染色質上這樣一個DNA不表達的區域[40]。此外，HIV基因多樣性是其治療的一大難題，這一點在HIV治療性抗體的研究方面最為顯著，HIV基因的多樣性是HIV逃避免疫系統監視及抵制抗病毒藥物的重要原因。DNA編輯療法對病毒的保守區域和同時編輯多個區域的病毒基因組是可行的，但HIV基因多樣性成為通過DNA編輯清除原代細胞病毒庫的阻礙。直接編輯不表達的HIV基因仍然是一個很大的挑戰?？傮w來說，編輯潛伏的前HIV DNA 是一種十分有潛力的病毒庫清除方式。

4.3 趕盡殺絕（kick and kill）主要是激活潛伏的病毒庫讓其表達相應的病毒蛋白，一旦相應病毒蛋白被表達，則認為這種宿主細胞是儲存有病毒庫的感染細胞，免疫效應機制和抗病毒治療就可以殺傷這一類產生病毒蛋白的細胞。如果病毒的激活過程有HAART的介導，那么新一輪的病毒復制將會被抑制。目前待解決的問題是如何安全有效的誘導潛伏HIV 表達相應的病毒蛋白。

安全有效的誘導潛伏HIV表達的方法仍在研究中。抗體（抗CD-3）、細胞因子（IL-2）以及組蛋白去乙?；敢种苿ū焖幔┑确椒ㄒ褢糜诮邮芸共《局委煹幕颊遊41-43]，這些方法為激活潛伏病毒提供了重要的信息，雖然它們對HIV病毒庫的表達和大小有不同程度的影響效果，但是在HAART停止的情況下，沒有一種方法能徹底清除病毒庫并阻止病毒庫的反彈。是否存在其他可以誘導潛伏HIV表達的因素也還在研究之中，例如蛋白激酶這樣的小分子。在潛伏感染的細胞中，免疫抗體包括抗PD-1和抗CTLA4都有可能克服抑制信號的作用，因此其在激活宿主細胞誘導潛伏病毒表達方面起到很大作用[44-46]。

如果潛伏的病毒反轉錄產生高水平的病毒，那么相應的宿主細胞會被細胞病變效應殺死，然而在病毒表達蛋白很低的情況下，天然免疫不能很好的識別這類細胞，這種殺傷方法并不是很有效，尤其是病毒庫內含有抵抗細胞毒性淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte,CTL）表位的病毒。因此可以通過注入能特異性識別HIV的CTL表位來擴大細胞殺傷，或者將CTL設計為具有T細胞受體能特異性識別HIV的特異性細胞[47]，對病毒庫的清除將會有一定的幫助。

HIV表面蛋白表達在感染的宿主細胞表面，因此，要想快速的殺死潛伏感染的細胞就可以通過誘導病毒蛋白表達，如HIV gp120，并用相應的抗體介導細胞殺傷[48]。這種擴大范圍的殺傷是很值得研究的。當患者在進行HAART過程中，如果病毒正在進行復制，那么在潛伏感染的細胞誘導病毒表達的同時，HAART則能將其清除，并有可能實現病毒庫的徹底清除。

4.4 病毒庫標志物CD32a Descours等[49]最新研究發現，低親和力受體CD32a可能是一種可靠的潛伏HIV基因CD4+T 細胞的表面特征性標志物。研究者首先在體外建立HIV潛伏感染模型，用HIV感染靜息CD4+T細胞，后經分析發現CD32a表達明顯上調。于是他們從經HAART的HIV感染患者體內分離外周血，結果發現一群CD32a高表達的CD4+T細胞，在所有感染CD4+T細胞中表達CD32a的可達80%以上，并且這一群CD32a+CD4+T細胞內HIV載量是CD32a-CD4+T細胞的1000倍，這部分細胞內的HIV載量可占所有CD4+T細胞病毒儲存量的50%以上。這些結果說明了CD32a+CD4+T細胞是一個重要的病毒儲存庫。如果能被證實，CD32a的發現將會是尋求HIV治愈路上的重要突破。將來，CD32a+CD4+T細胞頻率可能作為HIV治療過程中臨床療效的診斷指標，或是通過這樣的標志物設計出具有靶向殺傷的藥物，從而達到清除病毒庫治愈艾滋病的目的。此項研究不足之處是缺乏不同性別、種族、年齡以及其他組織（腸道、淋巴結、骨髓等）是否存在差異的相關研究。

5 展 望

在過去的幾十年里，國內外學者對HIV病毒庫進行了大量的研究，主要有HIV病毒庫在細胞以及解剖結構中的分布，病毒庫的清除策略及免疫療法。然而病毒庫的持續存在依然是艾滋病治愈的一大難題。HIV前病毒整合到宿主染色體上長期穩定存在，復雜的細胞結構及解剖結構使感染HIV的宿主細胞逃脫免疫系統識別[50-51]。本文對國內外近年HIV病毒庫研究工作進行總結，便于相關研究工作者了解HIV病毒庫存在位置并尋求有效的方法將其徹底清除。CD32a的發現可以準確定位病毒庫并將其清除，這一發現為艾滋病的攻克帶來了新的曙光。

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Research advance in the strategies for the eradication of HIV reservoir

ZHANG He-qian,CHANG Wen-xian,JIAO Yan-mei,ZHANG Ji-yuan*,WANG Fu-sheng*
Department of Clinical Medicine,Bengbu Medical College,233000,China

*Corresponding authors.WANG Fu-sheng,E-mail:fswang302@163.com; ZHANG Ji-yuan,E-mail:uniquezjy@163.com

The persistence of HIV reservoir is an important cause of persistent infection and difficult to cure in HIV patients.It is difficult to completely remove the viral reservoir with HAART at present.Studies have confirmed that HIV reservoir exists in various types of CD4+T cells,including central memory CD4+T cells,CCR4+CCR6+and CXCR3+CCR6+CD4+T cells,stem cell like memory CD4+T cells,Vγ9Vδ2 T cells and recently confirmed Tfh cells.In addition,studies have also found that macrophages and B cells also couple with viral reservoir.Currently,HIV reservoir eradication strategies mainly include CCR5 gene defective hematopoietic stem cell transplantation,gene editing and activation then killing.These methods still can not effectively remove HIV reservoir.Recent studies have shown the specifically high expression of CD32a molecules on the surface of HIV latent CD4+T cells,which provides new marker for the elimination of viral reservoir.We review the possible immunocytes with HIV reservoir and the research progress on the eradication strategies of HIV reservoir.

HIV reservoirs; immunocytes; eradication strategies

R512.91

A

1007-8134(2017)06-0321-06

10.3969/j.issn.1007-8134.2017.06.002

首都特色基金（Z161100000516011）

233000，蚌埠醫學院臨床醫學系（張和倩、常文仙）；100039 北京，解放軍第三○二醫院感染性疾病診療與研究中心（焦艷梅、張紀元、王福生）

王福生，E-mail:fswang302@163.com；張紀元，E-mail:uniquezjy@163.com

（2017-09-25收稿 2017-10-20修回）

（本文編輯 胡 玫）