T-SPOT聯合CD4+T淋巴細胞計數早期診斷HIV/AIDS合并肺結核潛伏感染的診斷價值分析

李智勇 李永春 陳 焰 郭健文

廣東省佛山市南海區人民醫院，廣東佛山 528200

T-SPOT聯合CD4+T淋巴細胞計數早期診斷HIV/AIDS合并肺結核潛伏感染的診斷價值分析

李智勇 李永春 陳 焰 郭健文

廣東省佛山市南海區人民醫院，廣東佛山 528200

目的探討結核（TB）感染T細胞酶聯免疫斑點試驗（T-SPOT）與CD4+T淋巴細胞計數聯合應用對艾滋病（HIV/AIDS）合并肺結核潛伏感染（LTBI）早期診斷的價值。方法選取2014年7月～2017年4月我院人類免疫缺陷病毒（HIV）陽性（+）感染者20例，其中合并LTBI的10例患者作為HIV（+）TB待排組，其余作為單純HIV（+）組；HIV陰性（-）30例，合并LTBI 的10例患者作為HIV（-）TB待排組，其余作為單純HIV（-）組。以診斷TB標準（病原學檢驗）做參照，以上述四組人員為對象，比較結核菌素實驗（TST）和T-SPOT診斷TB 的靈敏度、特異性、準確度、陽性預測值和陰性預測值，比較TST與T-SPOT診斷TB的一致性，以及CD4+細胞計數對兩者的影響。結果T-SPOT在TB診斷中，靈敏度、特異度、準確度均明顯高于TST，在HIV（+）TB待排組和HIV（-）TB待排組中，T-SPOT和TST診斷TB一致性良好（Kappa＞0.75）。CD4+T淋巴細胞計數增加能夠引起T-SPOT與TST對TB診斷的靈敏度、特異性和準確性的明顯增加，且T-SPOT優于TST。結論在AIDS合并LTBI人群中，T-SPOT對TB診斷的靈敏度、特異性和準確度均明顯高于TST，且T-SPOT對TB的診斷價值隨著CD4+T淋巴細胞計數增加而提高。

結核酶聯免疫斑點試驗；CD4+T淋巴細胞；結核病；診斷

R378.911

A

2095-0616（2018）01-22-04

廣東省佛山市醫學類科技攻關項目（2014AB000582）。

Value of T-SPOT combined with CD4+T lymphocyte count in early diagnosis of HIV/AIDS with latent tuberculosis infection

LI Zhiyong LI Yongchun CHEN Yan GUO Jianwen
Guangdong Province Foshan City Nanhai District People's Hospital,Foshan 528200,China

ObjectiveTo investigate the value of T-cell enzyme-linked immunospot assay (T-SPOT) for pulmonary tuberculosis(TB)and CD4+T lymphocyte count in early diagnosis of acquired immunodeficiency syndrome(HIV/AIDS) with latenttuberculosis infection (LTBI).MethodsTwenty cases of human immunodeficiency virus (HIV)positive (+) patients who were admitted to our hospital during the period from July 2014 to April 2017 were enrolled in the study.10 cases with LTBI were included into HIV (+) TB for eliminationgroup and the other were included intosimple HIV (+) group.There were 30 HIV negative (-) cases,10 cases with LTBI were included into HIV (-) TB for eliminationgroup,and the other were included into simple HIV (-) group.With the diagnostic criteria of TB (etiological test) as the reference,the sensitivities,specificities,accuracy rates,positive predictive values,negative predictive values and the consistencies were compared between tuberculin skin test (TST) and T-SPOT in the diagnosis of TB.The influence of CD4+cell count on the two was also compared.ResultsThe sensitivity, specificity and accuracy of T-SPOT in diagnosis of TB were significantly higher than those of TST.In HIV (+) TB for eliminationgroup and HIV (-)TB for elimination group,the consistenciesof T-SPOT and TST are good in diagnosis of TB (Kappa＞0.75).The increase of CD4+T lymphocyte count can significantly increase the sensitivities,specificities and accuracy rates of T-SPOT and TST in the diagnosis of TB,and T-SPOT was better than TST.ConclusionThe sensitivity,specificity and accuracy of T-SPOT in the diagnosis of TB in patients with AIDS complicated with LTBI are significantly higher than those of TST,and the value of T-SPOT in the diagnosis of TB increases with the increase of CD4+T lymphocyte count.

T-cell enzyme-linked immunospot assay for pulmonary tuberculosis;CD4+T lymphocyte;Tuberculosis;Diagnosis

結核病（TB）是艾滋病患者常見的并發癥，早期病原學陽性率低，不易被診斷，使艾滋病死亡率增高，目前在臨床上使用的諸多方法中，均不能同時有效保障高靈敏度和高特異性[1]。通過進一步研究，近年來學者發現結核感染T細胞酶聯免疫斑點試驗（T-SPOT）對TB的診斷有較高的靈敏度和特異度，但 CD4+T淋巴細胞計數對診斷結果有影響[2-4]。本研究以30例結核病患者與20例健康受試者為對象，對比T-SPOT與常規診斷方法結核菌素實驗（TST）做對比，并結合CD4+淋巴細胞計數，綜合診斷TB，以期為TB的診斷提供更準確的方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2014年7月～2017年4月收治的30例HIV合并LTBI患者，按照臨床癥狀表現分為三組，每組10例，無咳嗽、發熱等結核病表現，但近期密切接觸過活動性肺結核患者：病原學檢測HIV病毒呈陽性，記為組1，HIV（+）TB待排組；HIV感染陰性，為組2，HIV（-）TB待排組。不來自結核病高發區域，不在結核傳播高危環境工作且無活動性結核密切接觸史和吸毒史，不合并其他臟腑器官疾病：病原學檢測HIV病毒呈陽性，為組3，單純HIV（+）組；HIV感染陰性，為組4，單純HIV（-）組。組4由符合條件的我院20例健康醫務人員組成。以上四組人員年齡，男女分別為36和24例，年齡20～50歲，平均（35.6±5.6）歲，四組人員在性別、年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；對所有待檢者進行血沉（ESR）、腺苷脫氨酶（ADA）、結核抗體、病原學和影像學檢測。

1.2 方法

1.2.1 T-SPOT檢測 按照試劑盒（英國Oxford Immunotec公司）說明書進行，取枸櫞酸鈉抗凝靜脈血5mL，加入淋巴細胞抗原分離液，離心，取下層血樣配制成細胞液，放入培養箱中培養，采用PBS洗板清晰，孵育，再用PBS清洗，加蒸餾水，烘干；結果判斷：空白對照孔斑點數＞6，任一實驗孔斑點數減去空白孔斑點數大于6，記為陽性；空白對照孔斑點數＞6，任一實驗孔斑點數大于空白孔斑點數的兩倍也表示陽性，陽性結果即診斷為LTBI[2]。

1.2.2 結核菌素實驗(TST) 取0.1mL體積的結核菌素純蛋白衍生物（PPD）（含5單位結核菌素，S10960016，北京祥瑞生物制品有限公司，50IU/mL，1mL/支）對患者行前臂尺側皮內試驗，72h后觀察檢測結果，判斷標準：對HIV（+）患者，陽性反應為皮膚硬結直徑≥5mm，對HIV（-）人員，陽性反應為硬結直徑≥15mm[5]。

1.2.3 CD4細胞計數檢測 采用流式細胞術，主要操作步驟：取標記抗體10uL，將測定標本加入后震動混勻，然后避光放置15～20min再加入溶血素（免洗）震動混勻，再避光放置15～20min后加入PBS平衡10S，最后將與測定標本等量的計數微球加入后上機測定即可[6]。

1.2.4 診斷標準 即病原學檢測：清晨空腹留取每組人員痰液。取痰標本進行涂片后再抗酸染色（24h內），TB陰性：抗酸染色陰性；TB陽性：抗酸染色陽性[7]。

1.3 觀察指標

以標準做參照，觀察T-SPOT和TST對TB診斷的敏感度、特異度和準確度，計算陽性預測值和陰性預測值；觀察CD4+T淋巴細胞計數對兩者診斷TB的影響。

1.4 統計學分析

應用SPSS19.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以（x±s）表示，采用獨立樣本t檢驗，計數資料以百分數表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TST、T-SPOT診斷結果與標準比較

分別收集應用TST法和T-SPOT法診斷各組中TB的陽性病例和陰性病例，并與采用金標準診斷的陽性病例和陰性病例對比。以金標準為100%診斷正確，當金標準為陽性，TST或T-SPOT為陽性，說明該方法診斷為真陽性；當金標準為陽性，TST或T-SPOT為陰性，說明該方法診斷為假陰性；當金標準為陰性，TST或T-SPOT為陽性，說明該方法診斷為假陽性，當金標準為陰性，TST或T-SPOT為陰性，說明該方法診斷為真陰性。以此評價TST和T-SPOT對TB診斷的靈敏度、特異度、正確度、陽性預測值和陰性預測值。見表1。

表1 TST、T-SPOT診斷結果與標準比較

表2 TST、T-SPOT診斷TB靈敏度、特異度和正確度比較（%）

表3 TST、T-SPOT診斷肺結核一致性分析結果

表4 CD4淋巴細胞計數對TST與T-SPOT的影響（%）

2.2 TST、T-SPOT診斷TB靈敏度、特異度和正確度比較

由表1數據，計算TST、T-SPOT診斷的靈敏度、特異度、正確度、陽性預測值和陰性預測值。與同組人員比較，T-SPOT診斷的靈敏度、特異度、正確度、陽性預測值、陰性預測值均明顯高于TST，見表 2。

2.3 TST、T-SPOT診斷肺結核一致性分析

TST與T-SPOT在HIV(+)TB待排組一致性檢驗Kappa值為0.80，在HIV(-)TB待排組Kappa值為0.78，一致性均為良好（Kappa＞0.75）。見表3。

2.4 CD4淋巴細胞計數對TST、T-SPOT的影響

CD4+T淋巴細胞數目的增加，引起TST與T-SPOT檢驗靈敏度、特異性、準確度增加，同組比較可知，T-SPOT優于TST。見表4。

3 討論

艾滋病是由于感染攻擊機體CD4+T淋巴細胞的HIV病毒引起，HIV病毒入侵機體，會導致免疫系統癱瘓，為各種病原菌感染提供便利，較難治愈，死亡率較高，其中TB是艾滋病人群非常容易感染的并發癥，能促進患者病情惡化，加速患者死亡，危害極大，對于免疫系統已經受損的機體來說，感染TB后，早期臨床表現并不明顯，此時稱為結核潛伏感染（LTBI），結核桿菌在免疫系統低下的機體內能重新大量復制，出現臨床癥狀時已經發展成了活動性肺結核[8]。因此，針對HIV合并TB的雙重感染，及時診斷，就能避免延誤治療時機，及時切斷病菌的進一步傳播，降低死亡率。臨床上TB傳統診斷主要依靠涂片法、影像學檢查、培養法、結核抗體法、血沉檢查等，每一種檢查方法都有明顯的缺陷，診斷的可靠性較低[9-10]。作為TB檢驗金標準的病原學涂片，無法辨識死菌和活菌，對結核分枝桿菌及其分枝也不能較好的區分，而培養法耗時較長，除此之外，上述方法在HIV合并TB的患者中也不能獲得較高的陽性率[11]。由于機體CD4+T淋巴細胞計數越低，患者臨床癥狀表現越不明顯，從而影響影像學診斷的正確率， ESR、結核抗體等不能檢測患者血清中的所有結核抗體，且存在干擾[12]。TST所用PPD為混合蛋白，與卡介苗等非結核分枝桿菌（NTM）之間也能發生反應，導致在TB的診斷過程中出現假陽性率，受到免疫抑制劑的影響而出現假陰性率，同時，該實驗主要依靠醫務人員主觀判讀，容易存在一定的誤差，導致診斷結果不夠精確[13]。T-SPOT診斷TB感染是依靠酶聯斑點雜交計數（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）檢測體外活化的免疫細胞數，通過觀察細胞數目變化，判斷TB感染是否存在，該法以ESAT-6 和 CFP-10蛋白作為診斷抗原，刺激外周血淋巴細胞產生IFN-γ，較好的避開了普遍缺失這兩種蛋白的 BCG和非結核桿菌的干擾，擁有很高的特異性，除此之外，該方法在體外進行試驗，24 ～ 48h即可通過儀器客觀判讀結果，較快較好的降低誤差率[14]。通過研究文獻發現，目前對TB診斷的方法均能受到機體免疫狀態的影響，機體最重要的免疫細胞CD4+T淋巴細胞，在HIV患者中大量被HIV病毒攻擊，導致免疫反應不明顯而不能很好的診斷HIV合并TB[15]。準確評估患者細胞免疫狀況的關鍵，是快速精確的檢測CD4+T淋巴細胞的計數，需采用最先進最準確的免疫檢測方法，流式細胞術是目前最常用的，同時也符合本研究要求[11-12]。

本研究結果表明，T-SPOT與TST在HIV（+）TB待排組和HIV（-）TB待排組中診斷的一致性良好，CD4+T淋巴細胞計數增加會引起T-SPOT與TST對TB診斷的靈敏度、特異性和準確度提高，且T-SPOT明顯優于TST。提示HIV（+）患者免疫功能低下，CD4+T淋巴細胞數目減少，對TST診斷結果造成較大偏差，使得T-SPOT檢測結果更為可信。本研究結果與文獻報道一致[9-12]。

綜上所述，考慮到CD4+T淋巴細胞計數的影響，T-SPOT對HIV合并LTBI早期診斷比TST更有價值，值得在臨床擴大應用。

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2017-08-15）