三陰性乳腺癌組織中ALDH1、TGF-β1蛋白的表達變化及其對預后的影響

郭崇勇，丁寶忠，李柏成，楊堯堯，周凌，賈宗師

(1濱州市人民醫院，山東濱州 256600；2上海市第四人民醫院)

三陰性乳腺癌組織中ALDH1、TGF-β1蛋白的表達變化及其對預后的影響

郭崇勇1，丁寶忠1，李柏成1，楊堯堯1，周凌2，賈宗師1

(1濱州市人民醫院，山東濱州 256600；2上海市第四人民醫院)

目的探討乳腺腫瘤干細胞標志物乙醛脫氫酶1(ALDH1)與轉化生長因子β1(TGF-β1)在三陰性乳腺癌中的表達變化及其對預后的影響。方法收集60例三陰性乳腺癌患者術中切取的乳腺癌組織，采用免疫組織化學染色法檢測乳腺癌組織中ALDH1與TGF-β1蛋白的表達。術后所有患者行化療，并隨訪6～60個月，采用Kaplan-Meier檢驗進行生存分析，采用COX比例風險模型分析預后影響因素。結果60例三陰性乳腺癌組織中ALDH1蛋白陽性23例(38.33%)，TGF-β1蛋白陽性29例(48.33%)。ALDH1、TGF-β1蛋白陽性表達患者的5年總生存率均低于陰性患者(P均<0.05)。COX比例風險模型分析顯示，ALDH1蛋白表達為三陰性乳腺癌的獨立預后因素(HR=4.70，P<0.05)。三陰性乳腺癌組織中ALDH1蛋白表達與TGF-β1表達呈正相關(r=0.506，P=0.001)。結論三陰性乳腺癌組織中ALDH1蛋白表達增高，與TGF-β1表達呈正相關，ALDH1為三陰性乳腺癌患者預后判斷的獨立影響因素。

乳腺腫瘤；腫瘤干細胞；乙酰脫氫酶1；轉化生長因子β1

三陰性乳腺癌好發于40歲以下的絕經前女性，具有較高的侵襲性和異質性，較其他亞型預后差，較早發生復發和轉移，無病生存期和總生存率較低。有效改善預后是目前治療的難點。腫瘤干細胞是一類具有自我更新、多向分化等特性的腫瘤細胞亞群，腫瘤干細胞學說的提出為乳腺癌的治療提供了全新的思路[1, 2]。近年研究證實，乙醛脫氫酶1(ALDH1)被認為是乳腺腫瘤干細胞的特異性標志物[1]。本課題組前期研究證實，三陰性乳腺癌組織中ALDH1表達增高[3]。轉化生長因子β1(TGF-β1)通路是介導細胞上皮向間質轉化(EMT)的主體，而EMT是細胞獲得干細胞特性的一種途徑[4]。因此，我們推測TGF-β1通路可能參與調控乳腺腫瘤干細胞。2010年2 月～2017年2月，我們觀察了60例三陰性乳腺癌患者腫瘤組織中ALDH1與TGF-β1蛋白的表達及其對預后的影響，探討ALDH1與TGF-β1蛋白在三陰性乳腺癌中的表達變化及意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2010～2012年我院乳腺外科收治的三陰性乳腺癌患者60例，均為女性，年齡(51.32±11.70)歲。三陰性乳腺癌診斷標準：雌激素受體、孕激素受體表達陽性率<1%視為陰性；人類表皮生長因子2表達為-或+為陰性；人類表皮生長因子2表達為++，行熒光標記的原位雜交技術檢測結果為陰性。納入標準：術前均未接受化療、放療、內分泌治療等抗腫瘤相關治療；患者均行乳腺癌改良根治術；術后按照美國國立綜合癌癥網絡指南予以相應的放化療。排除標準：Ⅳ期患者；隨訪資料不全者。

1.2 ALDHl、TGF-β1蛋白表達檢測 采用免疫組織化學辣根過氧化物酶(HRP)法。取術中切取的乳腺癌組織，制備3 μm厚度連續切片，切片脫蠟、水化、抗原修復；滴加一抗，4 ℃過夜。滴加HRP試劑，DAB染色，蘇木素復染。具體操作按說明書進行。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，以已知陽性標本作為陽性對照。免疫組化結果判定由2名富有經驗的病理科醫師對染色結果進行讀片判定。每張切片隨機選取10個高倍視野，每個視野計數100個細胞，取其均值。ALDH1、TGF-β1蛋白染色主要位于細胞質。按切片中細胞有無顯色及顯色深淺進行評分，無顯色為0分，淺棕色為1分，深棕色為2分。按顯色細胞比例進行評分：0%～10%為0分，11%～30%為1分，31%～70%為2分，>71%為3分。以上述2項評分之和作為積分，按積分高低判定表達水平，0分為陰性，1～2分為低表達，3～5分為高表達。

1.3 化療及隨訪方法 所有患者均術后予以化療，包括CMF方案6個周期(環磷酰胺+甲氨蝶呤+氟尿嘧啶)化療10例，CEF方案6個周期(環磷酰胺+表柔比星+氟尿嘧啶)化療15例，TEC方案6個周期(多西他賽+表柔比星+環磷酰胺)化療35例。每半年進行電話隨訪一次，直至患者死亡事件發生。隨訪截止時間為2017年2月28日。共隨訪6～60個月。

1.4 統計學方法 應用SPSS21.0統計軟件。計數資料用率表示，采用χ2檢驗。ALDH1蛋白與TGF-β1蛋白表達的相關性應用Spearman相關性分析。生存分析采用Kaplan-Meier檢驗比較生存差異，采用COX比例風險模型分析預后影響因素。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三陰性乳腺癌組織中ALDH1、TGF-β1蛋白的表達 ALDH1蛋白主要分布于細胞質內，TGF-β1蛋白主要分布于腫瘤細胞質內。60例乳腺癌原發灶中ALDH1蛋白陽性23例(38.33%)，TGF-β1蛋白陽性29例(48.33%)。

2.2 不同臨床病理特征患者的ALDH1、TGF-β1蛋白表達比較 見表1。

表1 不同臨床病理特征患者的ALDH1、TGF-β1蛋白表達比較(例)

2.3 ALDH1蛋白表達陽性、陰性患者的生存分析結果 ALDH1蛋白表達陽性患者的5年中位生存時間為(42.00±3.11)個月，5年總生存率為34.79%；ALDH1蛋白表達陰性患者的5年中位生存時間為(53.84±2.19)個月，5年無病生存率為78.38%。ALDH1蛋白表達陽性患者的5年總生存率低于陰性患者(χ2=11.23，P=0.001)。COX比例風險模型分析顯示，ALDH1蛋白表達為三陰性乳腺癌的獨立預后因素(HR=4.70，P<0.05)。

2.4 TGF-β1蛋白表達陽性、陰性患者的生存分析結果 TGF-β1蛋白表達陽性患者的5年中位生存時間為(44.41±3.02)個月，5年總生存率為48.28%；TGF-β1蛋白表達陰性患者的5年中位生存時間為(53.87±2.20)個月，5年總生存率為74.19%。TGF-β1蛋白表達陽性患者的5年總生存率低于陰性患者(χ2=4.88，P=0.027)。

2.5 三陰性乳腺癌組織中ALDH1與TGF-β1表達的相關性 三陰性乳腺癌組織中ALDH1蛋白表達與TGF-β1表達呈正相關(r=0.506，P=0.001)。

3 討論

三陰性乳腺癌是指雌激素受體、孕激素受體及人類表皮生長因子2表達均為陰性的乳腺癌，在乳腺癌中所占比例15%～20%，與其他亞型相比，通常發病年齡低，無特定治療靶點，無病生存期短，復發快，預后不良。大量數據證實，小部分具有干細胞特性的腫瘤細胞亞群具有較強的自我更新和分化的能力，可能是腫瘤最終復發的根源[1, 2]。因此，明確乳腺腫瘤干細胞在三陰性乳腺癌中發生發展的機制，可為有效治療該亞型乳腺癌提供作用靶點。

ALDH1是一組能將乙醛氧化為乙酸的同工酶，能保護細胞免受醛過氧化物的損害。研究證實，500個ALDH1+的乳腺腫瘤細胞即可在小鼠體內致瘤，ALDH1+腫瘤細胞具有自我更新、多向分化及較高致瘤的特性，可作為乳腺腫瘤干細胞的標志物[1]。既往研究表明，ALDH1蛋白在乳腺癌組織中表達比例較低，陽性率<10%。本課題組前期研究證實，ALDH1蛋白在三陰性乳腺癌組織中表達增高，達38.33%，表明在三陰性乳腺癌中腫瘤干細胞標志物ALDH1蛋白增高[3]，提示三陰性乳腺癌的預后不良與ALDH1蛋白表達增高即腫瘤干細胞比例增高有密切關系。研究發現，ALDH1可作為乳腺癌患者的獨立預后指標[3, 5]，且ALDH1也可作為三陰性乳腺癌的腫瘤干細胞標志物[6]。但ALDH1在三陰性乳腺癌中的表達變化及其對患者預后的影響尚不明確。本研究發現，ALDH1蛋白在三陰性乳腺癌組織中表達率為38.33%，提示在該亞型乳腺癌組織中表達增高，且與原發腫瘤大小、組織學分級、臨床分期及是否有淋巴結轉移無關，ALDH1陽性的患者5年總生存率低于ALDH1陰性患者，ALDH1蛋白表達為三陰性乳腺癌的獨立預后因素，提示三陰性乳腺癌的預后不良可能與腫瘤干細胞比例增高有關。

TGF-β通路是介導細胞EMT過程的主體。TGF-β信號通路參與調控腫瘤細胞的增殖、凋亡及侵襲轉移[7, 8]。研究表明，TGF-β1在乳腺癌的早期作為一種抑制因子發揮作用，而在乳腺癌的晚期則促進腫瘤的侵襲和轉移[9]。研究發現，TGF-β信號通路的相關基因在三陰性乳腺癌細胞系中呈高表達，TGF-β信號通路的激活能夠通過EMT促進三陰性乳腺癌細胞的侵襲和轉移，而EMT又是細胞獲得干細胞特性的一種途徑[4, 10]。TGF-β1/Smad4 信號通路在腫瘤干細胞的自我更新和分化過程中發揮著重要作用[11]。TGF-β信號通路的相關因子可由腫瘤細胞分泌，并在Basal-like型乳腺癌細胞微環境中呈現高表達[12, 13]。本研究發現，TGF-β1蛋白在三陰性乳腺癌中的陽性表達率為48.33%，且陽性患者的5年總生存率低于陰性患者，提示TGF-β1蛋白的表達與患者預后不良有關，TGF-β1蛋白的表達可能與乳腺腫瘤細胞的生物學行為密切相關，在介導腫瘤進展過程中發揮重要作用，從而導致患者預后不良。

TGF-β1的高表達與腫瘤細胞的侵襲、轉移密切相關，其可能機制是TGF-β1通過其下游的Smad信號通路調控EMT的產生，而EMT又是腫瘤細胞獲得干細胞特性的途徑。我們推測TGF-β1通路可能是通過調控EMT過程，進而調控ALDH1+乳腺腫瘤干細胞亞群的發生和發展。研究發現，TGF-β通路可調控乳腺腫瘤干細胞ALDH1亞群表達[14]。Shuang等[15]研究發現，膽囊癌組織中TGF-β1可通過EMT介導ALDH+腫瘤干細胞亞群產生。本研究發現，TGF-β1陽性患者5年總生存率明顯低于TGF-β1陰性患者，且其表達與腫瘤干細胞標志物ALDH1呈正相關關系，提示 TGF-β1通路與腫瘤干細胞的發生發展確有一定的相關性。 深入探討TGF-β1相關通路影響乳腺腫瘤干細胞特征的分子機制，可能會為三陰性乳腺癌的治療提供新的思路。

[1] Ginestier C, Hur MH, Charafe-Jauffret E, et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome[J]. Cell Stem Cell, 2007,1(5):555-567.

[2] Bonnet D, Dick JE. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell[J]. Nat Med, 1997,3(7):730-737.

[3] Zhou L, Li K, Luo Y, et al. Novel prognostic markers for patients with triple-negative breast cancer[J]. Hum Pathol, 2013,44(10):2180-2187.

[4] Zubeldia IG, Bleau AM, Redrado M, et al. Epithelial to mesenchymal transition and cancer stem cell phenotypes leading to liver metastasis are abrogated by the novel TGFbeta1-targeting peptides P17 and P144[J]. Exp Cell Res, 2013,319(3):12-22.

[5] Yu P, Zhou L, Wang J, et al. Prognostic relevance of ALDH1 in breast cancer:a clinicopathological study of 96 cases[J]. Chinese Ge J Clin Oncol, 2010,9(1):31-35.

[6] Ma F, Li H, Li Y, et al. Aldehyde dehydrogenase 1 (ALDH1) expression is an independent prognostic factor in triple negative breast cancer (TNBC)[J]. Medicine (Baltimore), 2017,96(14):e6561.

[7] Heldin CH, Landstrom M, Moustakas A. Mechanism of TGF-beta signaling to growth arrest, apoptosis, and epithelial-mesenchymal transition[J]. Curr Opin Cell Biol, 2009,21(2):166-176.

[8] Yang L, Pang Y, Moses HL. TGF-beta and immune cells: an important regulatory axis in the tumor microenvironment and progression[J]. Trends Immunol, 2010,31(6):220-227.

[9] Ikushima H, Miyazono K. TGF beta signalling: a complex web in cancer progression[J]. Nat Rev Cancer, 2010,10(6):415-424.

[10] Asiedu MK, Ingle JN, Behrens MD, et al. TGFbeta/TNF(alpha)-mediated epithelial-mesenchymal transition generates breast cancer stem cells with a claudin-low phenotype[J]. Cancer Res, 2011,71(13):4707-4719.

[11] Naber HP, ten Dijke P, Pardali E. Role of TGF-beta in the tumor stroma[J]. Curr Cancer Drug Targets, 2008,8(6):466-472.

[12] Bierie B, Moses HL. Tumour microenvironment: TGFbeta: the molecular Jekyll and Hyde of cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2006,6(7):506-520.

[13] Bueno L, de Alwis DP, Pitou C, et al. Semi-mechanistic modelling of the tumour growth inhibitory effects of LY2157299, a new type I receptor TGF-beta kinase antagonist, in mice[J]. Eur J Cancer, 2008,44(1):142-150.

[14] Nie Z, Wang C, Zhou Z, et al. Transforming growth factor-beta increases breast cancer stem cell population partially through upregulating PMEPA1 expression[J]. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2016,48(2):194-201.

[15] Shuang ZY, Wu WC, Xu J, et al. Transforming growth factor-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition generates ALDH-positive cells with stem cell properties in cholangiocarcinoma[J]. Cancer Lett, 2014,354(2):320-328.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.46.018

R725.2

B

1002-266X(2017)46-0061-03

山東省自然科學基金資助項目(ZR2014HP036)。

2017-07-22)