姜黃素抑制耐紫杉醇食管癌細胞的上皮間質轉化作用及機制探討*

李 克，徐淑寧，劉 鶯，李 帥，喬 磊，侯新芳，王居峰

(鄭州大學附屬腫瘤醫院/河南省腫瘤醫院消化內一科 450052)

姜黃素抑制耐紫杉醇食管癌細胞的上皮間質轉化作用及機制探討*

李 克，徐淑寧，劉 鶯，李 帥，喬 磊，侯新芳，王居峰△

(鄭州大學附屬腫瘤醫院/河南省腫瘤醫院消化內一科 450052)

目的建立耐紫杉醇食管癌(EC)細胞系EC9706/PTX，觀察姜黃素對EC9706/PTX細胞上皮間質轉化(EMT)的抑制作用并探討其機制，為耐藥EC的治療提供理論依據。方法用中等濃度間歇作用法建立耐紫杉醇EC細胞EC9706/PTX，四甲基偶氮唑藍(MTT)法測定細胞耐藥指數及交叉耐藥性，檢測不同濃度姜黃素對EC9706/PTX細胞增殖的抑制。使用細胞骨架染色、劃痕實驗、Transwell侵襲實驗檢測姜黃素對EC9706/PTX細胞形態變化、遷移和侵襲能力的影響。熒光定量PCR及蛋白免疫印跡(Western blot)檢測姜黃素對EC9706/PTX細胞中EMT相關分子標志物E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白、纖維連接蛋白在mRNA和蛋白水平的表達影響。Western blot檢測姜黃素對EC9706/PTX細胞中轉錄因子NF-κB p65及Snail在蛋白水平的表達影響。結果EC9706/PTX對紫杉醇的耐藥指數為28.4，對順鉑、阿霉素產生交叉耐藥性，姜黃素能夠抑制EC9706/PTX細胞的增殖。在20 μmol/L濃度的姜黃素作用下，EC9706/PTX細胞的遷移和侵襲能力明顯降低。熒光定量PCR及Western blot檢測顯示，細胞耐藥后E-鈣黏蛋白的表達明顯下調，而N-鈣黏蛋白表達則明顯上調，姜黃素逆轉了這一現象。Western blot檢測提示，EC細胞發生耐藥及EMT后， NF-κB p65及Snail蛋白的表達增強，姜黃素阻斷了這一作用。結論姜黃素能夠抑制紫杉醇耐藥EC細胞的增殖并且能夠逆轉紫杉醇耐藥EC細胞的EMT現象，其機制可能是通過抑制NF-κB-Snail信號通路實現的。

紫杉醇；食管腫瘤；姜黃素；上皮間質化

食管癌(esophageal cancer,EC)在發達國家和發展中國家均表現出高發病率和高病死率兩大特征。EC的治療方法包括手術、放療、化療和生物治療等，化療容易產生多藥耐藥性腫瘤細胞，而耐藥細胞易發生上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)[1]，EMT發生會促進癌侵襲、轉移，嚴重影響患者預后和生存期。姜黃素是一種植物多酚、可抑制多種腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞擴散和逆轉腫瘤耐藥性[2-3]。有學者證實，姜黃素可以通過抑制核因子κB(NF-κB)的激活，進而下調其下游重要轉錄因子Snail的表達，達到抑制癌細胞EMT的作用[4]。由此筆者提出假設：姜黃素可能通過NF-κB-Snail信號通路抑制EMT來發揮抗耐藥EC侵襲的作用。

1 材料與方法

1.1材料 紫杉醇、順鉑、阿霉素、5-氟尿嘧啶(5-FU，美國Sigma公司)。四甲基偶氮唑藍(MTT,美國Sigma公司)，E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、纖維連接蛋白(fibronectin)、NF-κB p65抗體、Snail抗體(英國Abcam公司)，Transwell(美國BD公司)，P-IkBɑ(Cell Signaling Technology公司)。

表1 引物序列及目的片段長度

1.2方法

1.2.1EC9706/PTX耐藥株的建立 采用中等濃度間歇作用法建立EC耐藥細胞EC9706/PTX。取對數生長期的EC9706細胞，藥物誘導劑量及過程如下： 2 mg/L 3次→4 mg/L 3次→6 mg/L 3次→ 10 mg/L 3次→歷經18個月，建立耐藥株。

1.2.2MTT法測定耐藥指數 取對數生長期細胞，以5×103個/孔接種于96孔板中，設3個復孔， 24 h后更換含有不同濃度紫杉醇、阿霉素、順鉑、5-FU的培養基，并設不加藥物的空白對照。48 h后加入MTT，培養4 h加入二甲基亞砜(DMSO)，用多功能酶標儀測定波長490 nm處的吸光度(A)值，用GraphPad Primer 5.0軟件計算細胞半數抑制濃度(IC50)，耐藥指數(RI)=IC50(EC9706/PTX)/IC50(EC9706)。

1.2.3姜黃素抑制EC9706/PTX細胞增殖實驗 取對數生長期的EC9706/PTX細胞消化后計數接種于96孔板中，設3個復孔。第2天換用含不同濃度姜黃素(0～80 μmol/L)的培養基， 48 h后用MTT法測定細胞生長指數。生長指數=實驗組A值/對照組A值，其中對照組即姜黃素濃度為0 μmol/L，實驗重復3次，待實驗結果出來后，選取合適的姜黃素濃度進行后續實驗。

1.2.4細胞劃痕實驗觀察姜黃素對EC9706/PTX遷移的作用 根據實驗1.2.3結果，選定20 μmol/L濃度的姜黃素做進一步實驗，實驗分為EC9706組，EC9706/PTX組，姜黃素作用EC9706/PTX組(姜黃素作用組)。將3組細胞接種到6孔板中，細胞增殖至融合后，用無菌小槍頭劃痕，拍照。用含2%血清的RPMI1640培養基繼續培養，24 h再拍照，對細胞間距變化進行統計， 細胞遷移率=細胞24 h時間距/細胞0 h時間距。

1.2.5細胞侵襲實驗 將Transwell小室水化2 h。取1×105個細胞用無血清RPMI1640稀釋至500 μL，小室外加入600 μL含20%血清的RPMI1640，30 h后取出小室，固定、染色、封片。顯微鏡下對穿過濾膜的細胞進行計數(計數5個視野，每組設3個平行孔)。

1.2.6細胞骨架染色觀察姜黃素對EC9706/PTX形態的影響 實驗分為EC9706組，EC9706/PTX組，姜黃素作用組。做細胞爬片，甲醛固定后用TritonX-100通透細胞，加入耦聯了熒光素的羅丹明染色30 min ，加入4′6-二脒基-2-苯基吲哚DAPI染色3 min，中性樹膠封片，熒光顯微鏡下觀察細胞骨架。

1.2.7熒光定量PCR檢測姜黃素對EC9706/PTX細胞EMT標志物mRNA水平的影響 收集EC9706組、EC9706/PTX組、姜黃素作用組的細胞，用Trizol法提取RNA，按照反轉錄試劑盒操作說明將獲得的總RNA轉錄成cDNA。以cDNA為模板擴增E-cadherin、N-cadherin、vimentin、fibronectin片段，引物見表1，以β-actin為內參。用熒光定量 PCR 儀所配軟件Rotor-Gene 6000 Series Software 對實驗結果進行分析。

1.2.8蛋白免疫印跡(Western blot) 實驗分為EC9706組、EC9706/PTX組、姜黃素作用組，檢測細胞的E-cadherin、N-cadherin、vimentin、fibronectin在蛋白水平的表達，以β-actin作為內參。細胞加入蛋白裂解液， BCA法測定總蛋白水平，電泳、轉膜、封閉、一抗、二抗孵育、洗膜、顯影、膠片掃描，圖像處理分析。

1.2.9Western blot檢測姜黃素對NF-κB-Snail信號通路的影響 實驗分為EC9706組、EC9706/PTX組，姜黃素對EC9706/PTX作用24 h組，收集3組細胞，用Western blot分別檢測NF-κB p65和Snail的表達，以GADPH作為內參。

2 結 果

2.1MTT檢測EC9706/PTX細胞藥物敏感性及姜黃素對其增殖的抑制 EC9706/PTX細胞的耐藥指數和交叉耐藥性見表1，食管癌耐藥細胞EC9706/PTX對紫杉醇的RI為28.4，對順鉑、阿霉素產生交叉耐藥性。用MTT法檢測姜黃素對EC9706/PTX增殖的抑制作用，見圖1，0～80 μmol/L姜黃素作用48 h后，EC9706/PTX細胞的增殖受到抑制，呈濃度依賴性，姜黃素濃度超過30 μmol/L時，出現顯著抑制，姜黃素對EC9706/PTX的IC50為43.4 μmol/L。根據MTT結果，為了避免姜黃素對細胞增殖的抑制影響后續實驗，本研究選擇20 μmol/L的姜黃素濃度進行下一步實驗。

表1 EC9706及EC9706/PTX對不同抗癌藥物的RI測定

圖1 不同濃度姜黃素作用48 h對EC9706/PTX 細胞的活性抑制作用

2.2姜黃素抑制EC9706/PTX 細胞的遷移侵襲 劃痕24 h，EC9706/PTX組細胞的遷移速度明顯快于EC9706組(t=11.42，P=0.000)，而在20 μmol/L濃度的姜黃素作用下，姜黃素作用組細胞遷移減慢，差異有統計學意義(t=7.89，P=0.000),見圖2。Transwell小室侵襲實驗檢測姜黃素對EC9706/PTX侵襲的抑制作用，取5個視野的平均值，實驗重復3次，觀察到EC9706/PTX組細胞的侵襲能力明顯高于EC9706組細胞(t=8.2，P=0.001)，而用20 μmol/L濃度的姜黃素對EC9706/PTX作用后，姜黃素作用組細胞的侵襲能力明顯下降，差異有統計學意義(t=6.5，P=0.004)，見圖3。

2.3細胞骨架染色觀察姜黃素對EC9706/PTX細胞形態的影響 EC9706/PTX組細胞與EC9706組細胞相比，細胞發生間質化變化，形態不規則，呈紡錘樣及成纖維細胞樣。在姜黃素作用下，細胞膜肌動蛋白聚集，偽足收縮，細胞發生皺縮，見圖4。

A:細胞劃痕試驗(×40)；B:遷移率分析圖

圖2細胞劃痕實驗檢測各組細胞遷移率

A:顯微鏡下穿膜細胞(×200)； B:穿膜細胞數

圖3 Transwell侵襲實驗

圖4 細胞骨架染色觀察姜黃素對各組細胞形態的影響(×1 000)

2.4熒光定量PCR及Western blot檢測姜黃素對EC9706/PTX細胞EMT標志物在mRNA和蛋白水平的影響 EC9706/TTX組細胞的E-cadherin表達明顯下調，N-cadherin表達明顯上調，姜黃素作用組這一現象發生逆轉，提示姜黃素可抑制耐紫杉醇食管癌細胞EMT現象。見圖5、6。

a:P<0.05,與EC9706/PTX組比較。

圖5各組E-cadherin、N-cadherin、vimentin、fibronectin的mRNA表達水平

A:各EMT相關蛋白Western blot圖；B:E-cadherin和N-cadherin條帶灰度分析圖

圖6各組E-cadherin、N-cadherin、vimentin、fibronectin的蛋白表達水平

A：NF-κB p65及Snail Western blot圖；B：Western blot條帶灰度分析圖；a:P<0.05,與EC9706/PTX組比較

圖7各組NF-κB p65和Snail蛋白表達水平

2.5姜黃素通過抑制NF-κB-Snail信號通路逆轉EMT 實驗分為EC9706組、EC9706/PTX組、姜黃素作用組，用Western blot檢測NF-κB p65和Snail的表達。如圖7所示，EC9706/PTX組NF-κB p65和Snail的表達均高于EC9706組，而姜黃素作用下，耐藥細胞中NF-κB p65的表達降低，同時Snail的表達被抑制。見圖7。

3 討 論

我國是EC高發國家，發病率逐年上升，而由于EC早期診斷困難，病死率很高。目前采取手術為主，放療、化療為輔的綜合治療，但是腫瘤細胞會對化療藥物產生耐藥性，耐藥細胞具有更強的遷移性，患者晚期常死于化療后的轉移。因此，尋求新的、不良反應小且有效的抗EC新藥是醫學界迫切需要解決的問題。姜黃素是從草本植物姜黃、郁金等根莖中提取的一種酚性色素，研究證實姜黃素具有抗腫瘤作用，而且毒性小[5-6]。姜黃素對耐藥細胞轉移遷移作用的影響研究較少，本實驗中建立了ECEC9706的耐紫杉醇細胞株，觀察姜黃素對耐藥細胞的抑制作用。

本實驗對EC9706的耐紫杉醇細胞株檢測了RI，發現該細胞株對紫杉醇具有很強的耐藥性，而且還對其他化療藥物阿霉素和順鉑產生交叉耐藥性，可以用作后續實驗。細胞周期的失控是腫瘤發病中的重要環節，有研究者發現姜黃素能使EC9706的細胞周期發生明顯變化，使EC細胞停滯于DNA合成期，腫瘤細胞生長延遲并逐漸死亡[6]。本實驗中用不同濃度的姜黃素作用于耐藥細胞，也會抑制細胞的增殖，并且具有濃度依賴性，這和其他學者的研究是一致的。

耐藥細胞株EC9706/PTX發生了EMT，細胞骨架染色顯示，EC9706親本細胞呈鋪路石樣，而耐藥細胞形態呈多樣化，以梭形和纖維樣為主，細胞排列松散有偽足。劃痕實驗和Transwell小室實驗顯示耐藥細胞的遷移和轉移能力增強。熒光定量PCR及Western blot檢測EC9706/PTX 細胞EMT標志物在mRNA和蛋白水平的變化，耐藥細胞的E-cadherin表達明顯下調，N-cadherin表達明顯上調，這些結果和其他學者的研究是一致的[7-8]。用姜黃素作用于耐藥細胞發現，姜黃素可以逆轉耐藥細胞的EMT，在形態上，耐藥細胞在姜黃素作用下，細胞變小，偽足收縮，遷移轉移能力下降，細胞表達的間皮標志N-cadherin下調而上皮標志E-cadherin表達上調，這對于腫瘤耐藥在臨床上的治療是有利的。

腫瘤細胞發生EMT是受多個信號通路調控的[9]，轉化生長因子-β(TGF-β)、Wnt蛋白、腫瘤壞死因子(TNF)及Notch蛋白均可誘導EMT發生[10-11]。核轉錄因子NF-κB的激活與腫瘤的侵襲和轉移有非常重要的關系。NF-κB與IκBɑ緊密結合，各種刺激信號可使IκBɑ磷酸化降解，導致NF-κB的p65磷酸化轉移到細胞核，NF-κB p65與下游基因的啟動子結合，引起多種細胞因子及遷移相關的蛋白表達[12-13]。Huang等[13]對乳腺癌細胞的研究表明，姜黃素能通過阻礙NF-κB-Snail信號使細胞耐受脂多糖(LPS)誘導的EMT[14]。

NF-κB 能夠結合到Snail 的啟動子上從而上調Snail轉錄[15]，本實驗也發現EC9706/PTX組中NF-κB p65和Snail的表達均高于EC9706組細胞，而姜黃素作用下，耐藥細胞中NF-κB p65的表達降低，同時Snail的表達被抑制。

綜上所述，姜黃素能夠抑制紫杉醇耐藥EC細胞的增殖并且能夠逆轉紫杉醇耐藥EC細胞的EMT現象，其機制可能是通過抑制NF-κB-Snail信號通路實現的。

[1]LiL,XuH,DongH,etal.MiR-181aupregulationisassociatedwithepithelial-to-mesenchymaltransition(EMT) and multidrug resistance(MDR) of ovarian cancer cells[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2016,20(10):2004-2010.

[2]馬泳泳，黃進，周淑娟，等．姜黃素對骨髓瘤細胞遷移和侵襲能力的影響及其機制研究[J]．中國病理生理雜志，2014，30(1)：170-174．

[3]劉斌，鄧辰亮，楊松林，等．姜黃素對人黑色素瘤細胞凋亡機制探討[J]．中華腫瘤防治雜志，2014，21(14)：1059-1062．

[4]Liao S,Xia J,Chen Z,et al.Inhibitory effect of curcumin on oral carcinoma CAL-27 cells via suppression of Notch-1 and NF-κB signaling pathways[J].J Cell Biochem,2011,112(4):1055-1065.

[5]曹一波，于君，馬晶，等．姜黃素對膠質瘤U87增殖和遷移能力的影響[J]．解放軍醫藥雜志，2014，26(5)：19-26．

[6]石松林，陳蘭英，劉用金，等．姜黃素誘導人食管癌EC9706細胞凋亡過程中核磷蛋白的表達與定位變化[J]．解剖學報，2014，45(2)：221-227．

[7]Radisky S,Radisky C.Matrix metalloproteinase-induced epithelial-mesenchymal transition in breast cancer[J].J Mammary Gland Biol Neoplasia,2010,15(2):201-212.

[8]馬平川，何宏月，王芳，等．上皮間質轉化相關蛋白E-cadherin、N-cadherin及Snail在子宮內膜異位癥相關卵巢癌的表達及意義[J]．實用婦產科雜志，2016，32(3)：211-215．

[9]田若楠，孫劍經，張林西．姜黃素抗食管癌的機制[J]．國際腫瘤學雜志，2016，43(5)：379-381．

[10]Felipe LJ,Nofech-Mozes S,Bayani J,et al.EMT in breast carcinoma——a review[J].J Clin Med,2016,5(7):65-79.

[11]吉鴻，盧桂芳，單濤，等．姜黃素通過NF-κB-Snail信號通路抑制LPS誘導的乳腺癌細胞上皮間質化[J]．西安交通大學學報(醫學版)，2014，35(3)：399-404．

[12]Cichon A,Nelson M,Radisky C.Regulation of epithelial-mesenchymal transition in breast cancer cells by cell contact and adhesion[J].Cancer Inform,2015,14(Suppl 3):1-13.

[13]Huang T,Chen Z,Fang L.Curcumin inhibits LPS-induced EMT through downregulation of NF-κB-Snail signaling in breast cancer cells[J].Oncol Rep,2013,29(1):117-124.

[14]Qin Y,Zhao D,Zhou G,et al.Apigenin inhibits NF-κB and snail signaling,EMT and metastasis in human hepatocellular carcinoma[J].Oncotarget,2016,7(27):41421-41431.

[15]Wang M,Ren D,Guo W,et al.N-cadherin promotes epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell-like traits via ErbB signaling in prostate cancer cells[J].Int J Oncol,2016,48(2):595-606.

TheinhibitioneffectsofcurcuminonEMTofPTX-resistantesophagealcancercelllineanditsmechanism*

LiKe,XuShuning,LiuYing,LiShuai,QiaoLei,HouXingfang,WangJufeng△

(DepartmentofOncology,CancerHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity/HenanCancerHospital,Zhengzhou,Henan450003,China)

ObjectiveTo establish the effect of curcumin on PTX-resistant esophageal cancer cell line EC9706/PTX and to investigate the mechanism of curcumin on the epithelial stromalization (EMT) of EC9706/PTX cells.MethodsEC9706/PTX cells were established by medium concentration intermittent method.The drug resistance index and cross resistance were measured by MTT assay.The inhibitory effects of different concentrations of curcumin on EC9706/PTX cell proliferation were detected.The effects of curcumin on the morphological changes,migration and invasion of EC9706/PTX cells were examined by cytostatic staining,scratching and transwell invasion assay.The effects of curcumin on the expression of E-cadherin,N-cadherin,vimentin and fibronectin in EC9706/PTX cells at mRNA and protein levels were detected by fluorescence quantitative PCR and Western blot.The effect of curcumin on the expressions of NF-κB p65 and Snail in EC9706/PTX cells were detected by Western blot.ResultsThe drug resistance index of EC9706/PTX was 28.4,which was cross-resistant to cisplatin and doxorubicin.Curcumin could inhibit the proliferation of EC9706/PTX cells.The migration and invasion of EC9706/PTX cells were significantly decreased under the action of curcumin at 20 μmol/L concentration.Fluorescence quantitative PCR and Western blot analysis showed that the expression of E-cadherin was down-regulated and the expression of N-cadherin was up-regulated,and curcumin reversed this phenomenon.Western blot analysis showed that the expression of NF-κB p65 and Snail protein was enhanced after PTX-resistant generated in EC cell,but curcumin reversed this phenomenon.ConclusionCurcumin can inhibit the proliferation，migration and invasion of EC9706/PTX cells.The mechanism maybe that curcumin inhibits the NF-κB-Snail pathway.

paclitaxcel;esophageal neoplasms;curcumin;epithelial-mesenchymal transition

河南省科技廳基礎與前沿項目(112300410044)。

李克(1976-)，副主任醫師，博士，主要從事腫瘤內科研究?！?/p>

，E-mail:13783583966@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.34.001

R571

A

1671-8348(2017)34-4753-04

2017-08-20

2017-09-28)