氫溴酸西酞普蘭預處理對大鼠局灶腦缺血再灌注損傷的影響*

李愛華，李 倩，郭 靜，李寶麗

(1.唐山職業技術學院，河北唐山 063004；2.華北理工大學醫學實驗研究中心，河北唐山 063009；3.唐山市協和醫院神經內科，河北唐山 063004)

氫溴酸西酞普蘭預處理對大鼠局灶腦缺血再灌注損傷的影響*

李愛華1，李 倩2△，郭 靜2，李寶麗3

(1.唐山職業技術學院，河北唐山 063004；2.華北理工大學醫學實驗研究中心，河北唐山 063009；3.唐山市協和醫院神經內科，河北唐山 063004)

目的觀察氫溴酸西酞普蘭預處理對大鼠局灶腦缺血再灌注損傷所致腦梗死體積、海馬CA1區細胞凋亡及超微結構的影響。方法將90只SD大鼠分為假手術組、缺血再灌注組(模型組)、氫溴酸西酞普蘭預處理高、中、低劑量組(給藥劑量分別為20、10、5 mg/kg,每天灌胃給藥1次，持續7 d)，末次灌胃2 h后采用線栓法制作大腦中動脈缺血2 h再灌注模型，再灌注24 h后，紅四唑氮(TTC)染色法檢測腦梗死體積，透射電鏡觀察損傷側海馬CA1區細胞超微結構，TUNEL法檢測損傷側海馬CA1區細胞凋亡并采用激光共聚焦顯微鏡進行觀察和數據測定。結果經氫溴酸西酞普蘭預處理各劑量組與模型組相比，大鼠腦梗死體積減小，差異有統計學意義(P<0.05)；海馬CA1區凋亡細胞表達明顯減弱，差異有統計學意義(P<0.05)；透射電鏡觀察可見氫溴酸西酞普蘭預處理各劑量組大鼠損傷側腦海馬CA1區細胞超微結構損傷較模型組明顯減輕；以上改變高劑量預處理組效果更為明顯。結論氫溴酸西酞普蘭預處理可減少腦缺血再灌注損傷所致細胞凋亡和梗死面積，具有腦保護作用。

氫溴酸西酞普蘭；再灌注損傷；細胞凋亡；海馬CA1區

缺血性腦卒中是老年人群的常見病，可造成老年人認知和軀體功能障礙，嚴重者可導致死亡。缺血性腦卒中在疾病發展或后期的治療過程中常因局部腦血流再通發生再灌注損傷，缺血再灌注損傷可引發神經元細胞發生兩種形式的死亡：即缺血中心區的壞死和缺血半暗區的生理性死亡(凋亡)[1]，目前減少缺血半暗區凋亡的發生是缺血性腦卒中治療的研究熱點。選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑即SSRI類藥物，是精神科臨床用于改善抑郁情緒的藥物，近年來有研究報道此類藥物對腦缺血具有神經保護作用[2-4]。其代表藥物氫溴酸西酞普蘭由于該藥對5-羥色胺再攝取抑制的選擇性相對較高,對其他神經遞質影響較小，因此藥物不良反應少，臨床應用廣泛。目前關于氫溴酸西酞普蘭在神經保護方面的研究報道較少，故本研究應用氫溴酸西酞普蘭對大鼠進行預處理干預治療，之后行大腦中動脈阻斷(middle cerebral artery occlusion，MCAO)缺血制作缺血再灌注模型，通過檢測大鼠腦梗死體積、海馬CA1區神經元細胞凋亡和超微結構的變化，觀察氫溴酸西酞普蘭預處理對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷是否具有保護作用，為氫溴酸西酞普蘭在臨床上的應用提供有意義的實驗依據。

1 材料與方法

1.1動物與分組 將清潔級健康雄性SD大鼠90只[體質量250～350 g，動物許可證號SCXK(京)2010-0013，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司]分為5組：假手術組，缺血再灌注組(模型組)，氫溴酸西酞普蘭預處理高、中、低劑量組每組18只。在屏障環境動物實驗室喂養1周后進入實驗。

1.2藥物、試劑和儀器 氫溴酸西酞普蘭(商品名為喜普妙，丹麥靈北制藥公司生產，批號：國藥準字J20080021，20 mg/片)，紅四氮唑(TTC)染色劑(購自美國Sigma公司)，TUNEL檢測試劑盒(購自北京中杉金橋生物技術有限公司)，透射電子顯微鏡(日立H-7650)及激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司FV1000型)由華北理工大學醫學實驗研究中心提供。

1.3干預方法 氫溴酸西酞普蘭灌胃給藥(高劑量組20 mg/kg、中劑量組10 mg/kg、低劑量組5 mg/kg)，每天1次，持續7 d，末次給藥2 h后大鼠行缺血再灌注模型制作，術后停止給藥。假手術組及模型組大鼠給予生理鹽水灌注。

1.4模型制作及判定標準

1.4.1模型制作 禁食12 h，10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉。手術過程中監測大鼠體溫并保持在37.0～37.5 ℃(采用肛溫探頭連接多功能監測儀Spacelab，USA)。參照曹勇軍等[5]改進的Longa線栓法制作MCAO缺血再灌注模型，阻斷2 h后，麻醉狀態下將線栓抽出10 mm行再灌注。假手術組線栓不阻斷大鼠大腦中動脈血流，插入深度不能超過9 mm。

1.4.2模型判定及入組標準 對照Zea Longa 5分法[4](神經功能無缺損0分；左前爪不能伸直1分；行走時向左側轉圈2分；行走時向左側傾倒3分；意識喪失4分)，觀察大鼠缺血再灌注24 h的動作表現，進行神經功能評分，得分為1～3分的大鼠進入后續試驗，按隨機原則補充被剔除的大鼠，保證數量不變。

1.5腦組織梗死體積測定 各組隨機選取缺血再灌注24 h大鼠6只，麻醉，留取腦組織冷凍0.5 h，從額極至枕極連續切取厚度為2 mm的冠狀腦片5片，37 ℃避光恒溫條件下用2% TTC磷酸緩沖液浸泡孵育30 min后，用4%多聚甲醛液固定2 h。正常腦組織TTC染色呈紅色，梗死腦組織呈白色。數碼相機拍攝圖像后應用AutoCAD 2000系統圖像分析軟件進行分析獲取數據，腦梗死面積=損傷對側半球的面積-損傷側TTC染色正常的面積，腦梗死體積=∑全部腦片梗死面積×腦片厚度，最后算出腦梗死體積占全腦體積的百分率。

1.6細胞凋亡檢測及觀察 各組隨機選取缺血再灌注24 h大鼠6只進行細胞凋亡的檢測，操作過程嚴格按照TUNEL法試劑說明書逐步進行，然后參照《大鼠腦組織立體定位圖譜》，在共聚焦顯微鏡下定位海馬CA1區，采用波長為488 nm氬離子激光激發FITC熒光染料產生綠色熒光，觀察細胞凋亡發生情況，在相同的參數下掃描取圖，各組圖像TUNEL表達的熒光D值數據由共聚焦顯微鏡應用分析軟件FV10-ASW采集獲得。

1.7超微結構觀察 各組隨機選取缺血再灌注24 h大鼠6只，麻醉，低溫冰盒上取出腦組織，留取0.5～1.0 mm3損傷側海馬CA1區腦組織，2.5%戊二醛固定，1%四氧化鋨后固定，乙醇、丙酮梯度脫水、環氧樹脂包埋、超薄切片、載網、醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛雙重染色后，應用透射電鏡觀察損傷側海馬CA1區腦組織超微結構變化并取圖拍照。

2 結 果

2.1腦梗死體積測定結果 大腦中動脈血流被阻斷后，大鼠損傷側的部分腦組織缺血梗死，梗死部位主要為基底節和皮層。實驗中可見，假手術組大鼠腦組織無梗死，模型組大鼠發生大面積腦梗死，梗死腦組織水腫明顯，較正常側體積增大，顏色蒼白，溝回變平、變淺；與模型組比較，氫溴酸西酞普蘭預處理各劑量組大鼠腦梗死體積均有不同程度的減少，差異有統計學意義(P<0.05)，高劑量組效果最為顯著，見表1。

2.2細胞凋亡檢測結果 TUNEL陽性判定：綠色熒光顆粒或明亮的綠色熒光團塊為凋亡產物，主要分布于細胞核內。假手術組無綠色熒光出現，對各組(圖1)的D值(表1)進行統計學分析可見，氫臭酸西酞普蘭預處理各劑量組大鼠海馬CA1區神經元D值較模型組明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)；且高劑量組的凋亡抑制作用最為顯著。

表1 各組大鼠腦梗死體積與凋亡檢測比較

a：P<0.01，與假手術組比較；b：P<0.05，c：P<0.01，與模型組比較；-：此項無數據

A:假手術組;B:模型組；C:低劑量組；D:中劑量組；E:高劑量組

圖1各組大鼠海馬CA1區細胞凋亡(激光共聚焦顯微鏡×400)

A:假手術組;B:模型組；C:低劑量組；D:中劑量組；E:高劑量組

圖2各組大鼠海馬CA1區腦組織超微結構(透射電鏡×18 000)

2.3超微結構觀察結果 假手術組大鼠海馬CA1區神經元形態規整，呈圓形或椎體形；核膜清晰光滑，染色質分布均勻，核仁完整；細胞質內線粒體豐富，呈圓形或棒槌形，內嵴排列規則整齊，糙面內質網散在或平行排列，核糖體均勻游離分布或附著于內質網上(圖2A)。模型組：海馬CA1區神經元細胞正常圓形或椎體形態消失，外形不規則；細胞核核膜內陷或者呈現缺損，異染色質增多，呈現塊狀或新月狀聚集于細胞核核膜下；細胞質內線粒體腫脹，嵴排列紊亂、斷裂、減少甚至消失，呈現空泡樣改變，內質網增加，板層狀排列，游離核糖體增加(圖2B)。氫溴酸西酞普蘭預處理各劑量組：與模型組比較，可見海馬CA1區部分神經元變性，胞體形態欠規整；細胞核核膜皺縮不明顯，異染色質增多，部分區域可見異染色質輕度聚集,核仁水腫減輕；線粒體輕度水腫，嵴大部分完整或僅有輕微排列紊亂，內質網輕度腫脹擴張，以高劑量組效果改善最為明顯(圖2C～E)。

3 討 論

對既往的實驗研究進行統計發現，大鼠的腦皮質、紋狀體、海馬和丘腦等部位的腦組織是線栓法制作的MCAO 模型的易損區[5]。其中，對缺血缺氧更為敏感的是海馬CA1區神經元，排列規則、分布集中是該區神經元的突出特點，這一特點不僅利于組織形態的觀察還有利于實驗數據的采取，并且鑒于海馬對于學習、記憶等高級認知功能的重要性，因此，本課題選取海馬CA1區為實驗觀察的部位。

TUNEL檢測技術用于凋亡細胞染色，發展成熟，學術界公認可靠。激光共聚焦顯微鏡的優勢在于不僅可對檢測細胞進行定位和形態觀察，還可以通過熒光的強弱進行定量測定和圖像定量分析[6]。因此，本項目將兩種方法有效結合， TUNEL染色后在激光共聚焦顯微鏡下觀察凋亡并掃描測定熒光D值。結果發現，與模型組相比，氫臭酸西酞普蘭預處理各劑量組大鼠缺血再灌注24 h后海馬CA1區神經元細胞凋亡程度均明顯減弱(P<0.05)，說明氫溴酸西酞普蘭預處理可以不同程度地抑制大鼠腦缺血再灌注損傷所致的細胞凋亡。

抗抑郁藥可能是通過減輕神經元損害，減少細胞凋亡，促進缺血區神經修復，而起到了改善卒中患者的抑郁狀態及促進神經功能康復的作用[7]，以上是既往的研究發現。本實驗中，模型組損傷側海馬CA1區神經元外形不規則，線粒體結構破壞，可見特征性的凋亡小體形成；較之于模型組，氫溴酸西酞普蘭預處理各組腦組織的神經元受損改變均明顯減輕，線粒體結構改變不明顯。腦缺血再灌注損傷誘導凋亡發生的途徑復雜多樣，主要有氧自由基損傷、鈣離子超載、內質網應激途徑及線粒體途徑等[8]。參與細胞凋亡的基因眾多，其中Bcl-2 家族主要通過調節線粒體膜上的通透性轉換孔，改變線粒體膜的通透性來實現對凋亡過程的調控[9-10]。本研究結果顯示氫溴酸西酞普蘭預處理可以抑制凋亡及線粒體結構的改變，但具體機制有待研究。

綜上所述，本研究結果表明氫溴酸西酞普蘭預處理可減少腦缺血再灌注損傷后凋亡的發生和腦梗死面積，對腦缺血再灌注損傷起到保護作用，該作用與其抗凋亡機制相關，為臨床上氫溴酸西酞普蘭預防和治療缺血性腦卒中提供了更堅實的理論依據。

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河北省科學技術研究與發展項目(132777218)；河北省唐山市科學技術研究與發展項目(12130268b)。

李愛華(1977-)，講師、主治醫師，碩士，主要從事腦血管病基礎與臨床研究?！?/p>

，E-mail:340154235@qq.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.34.023

R532

B

1671-8348(2017)34-4824-04

2017-08-25

2017-09-29)