鞘內注射右美托咪定對大鼠嗎啡耐受及脊髓炎性反應的影響*

鞏紅巖,鄭 芳,左志超,劉景景,王慶志,趙國安△

(1.新鄉醫學院第一附屬醫院麻醉科,河南新鄉 453000；2.新鄉醫學院第一附屬醫院醫學

鞘內注射右美托咪定對大鼠嗎啡耐受及脊髓炎性反應的影響*

鞏紅巖1,鄭 芳2,左志超1,劉景景1,王慶志3,趙國安1△

(1.新鄉醫學院第一附屬醫院麻醉科,河南新鄉 453000；2.新鄉醫學院第一附屬醫院醫學

目的探討鞘內注射右美托咪定對大鼠嗎啡耐受及脊髓炎性反應的影響。方法采用隨機數字表法將33只體質量180～200 g雄性SD大鼠，分為3組(n=11)：對照組(NS組)、嗎啡組(M組)、右美托咪定+嗎啡組(Dex組)。NS組鞘內注射無菌生理鹽水10 μL，1次/d，共7 d；M組鞘內注射嗎啡15 μg，1次/d，共7 d；Dex組鞘內注射15 μg嗎啡和1.5 μg右美托咪定，1次/天，共7 d。于嗎啡鞘內注射第1、3、5、7天給藥前和給藥后30 min測定大鼠的熱痛閾。Western blot法檢測脊髓中小膠質細胞標記物Iba-1、白細胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和磷酸化p38MAPK(p-p38)的蛋白表達水平。免疫組織化學法檢測脊髓Iba-1陽性細胞密度。結果隨著嗎啡鞘內注射次數增加，M組和Dex組熱水甩尾實驗最大鎮痛效應百分比(MPE)逐漸下降(P<0.05)。與NS組比較，M組甩尾實驗MPE在嗎啡注射的第1、3、5、7天較高(P<0.05)；與M組比較，Dex組甩尾實驗MPE于嗎啡注射的第3、5、7天較高(P<0.05)。與NS組比較，M組大鼠脊髓Iba-1陽性細胞密度及Iba-1、IL-1β、TNF-α和p-p38蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與M組比較，Dex組大鼠脊髓Iba-1陽性細胞密度及Iba-1、IL-1β、TNF-α和p-p38蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。結論鞘內注射右美托咪定可緩解嗎啡耐受的形成，其機制可能與抑制脊髓小膠質細胞介導的炎性反應相關。

右美托咪定；嗎啡；藥物耐受性；小膠質細胞；炎癥

嗎啡在神經病理性痛和晚期癌痛等慢性疼痛的治療中應用廣泛，但長期反復使用可誘發藥物耐受現象[1-2]。最近的研究表明，嗎啡耐受的形成機制可能與脊髓小膠質細胞激活相關[1-3]。激活的小膠質細胞可誘發促炎因子的釋放，干擾脊髓神經元的正常功能甚至導致神經元凋亡。而右美托咪定是臨床上廣泛應用的鎮靜藥物。動物實驗表明，右美托咪定可抑制脊髓損傷誘發的小膠質細胞激活和炎癥因子釋放[4-5]。因此，本實驗擬探討鞘內注射右美托咪定對嗎啡耐受形成及脊髓炎性反應的影響。

1 材料與方法

1.1主要材料和設備 右美托咪定(批號90619DK，Abbott公司，美國)，嗎啡(批號070901，沈陽第一制藥廠)，BCA試劑盒(批號AR1110，武漢博士德生物工程有限公司)，抗小膠質細胞標記物Iba-1抗體(批號016-20001，Wako公司，日本)，磷酸化p38MAPK(p-p38)抗體(批號ab178867，Abcam公司，美國)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體(批號ab6671，Abcam公司，美國)，白細胞介素1β(IL-1β)抗體(批號sc-7884，Santa Cruz公司，美國)，β-actin抗體(批號BM0627，武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2實驗分組 33只體質量180～200 g雄性SD大鼠，購自新鄉醫學院實驗動物中心。采用隨機數字表法，分為3組(n=11)：對照組(NS組)、嗎啡組(M組)、右美托咪定+嗎啡組(Dex組)。NS組鞘內注射無菌生理鹽水10 μL，1次/d，共7 d；M組鞘內注射嗎啡15 μg(溶于生理鹽水)，1次/d，共7 d，以建立嗎啡耐受模型[6]；Dex組鞘內注射15 μg嗎啡和1.5 μg右美托咪定[7]，1次/d，共7 d。于嗎啡鞘內注射第1、3、5、7天給藥前和給藥后30 min行痛閾測定。

1.3鞘內置管 參照文獻[4-5]，于嗎啡注射前行鞘內置管術。腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg/kg，于正中線L4～5間隙處切開皮膚，分離周圍軟組織，經椎間隙輕輕刺破硬脊膜及蛛網膜，可見清亮的腦脊液流出，之后將PE-10導管置入約8 cm。置管后仔細固定導管并縫合傷口。鞘內試驗性注射1%利多卡因20 μL(利多卡因實驗)，如30 s后大鼠出現雙后肢癱軟，則表明鞘內置管成功。利多卡因實驗陰性或術后出現四肢癱瘓、單側肢體癱瘓者則不納入后續實驗。

1.4痛閾測定 參照文獻[2-3,8]，分別采用熱水甩尾實驗測量熱痛閾。熱痛閾測定：將大鼠尾末端1/3浸入50 ℃熱水中，記錄鼠尾浸入水中至出現甩尾反應的時間。為避免鼠尾損傷，限定浸入時間不超過10 s，如浸入時間達到15 s仍不出現甩尾反應，記為15 s。給藥前和給藥后30 min各進行3次甩尾實驗，每次間隔5 min，取平均值作為最終的熱痛閾值。計算最大鎮痛效應百分比(MPE)，MPE=(給藥后熱痛閾-基礎熱痛閾)/(10.0-基礎熱痛閾)×100%。

1.5Western blot檢測 最后一次痛閾測定后，每組取6只大鼠，使用過量的戊巴比妥鈉(80 mg/kg)處死，取出L4～6節段的脊髓，采用蛋白提取試劑盒提取脊髓蛋白，并使用BCA試劑盒測定樣本蛋白濃度。蛋白采用聚丙烯酰胺凝膠電泳后電轉至0.45 μm孔徑的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%的脫脂牛奶中室溫封閉1 h后，加入β-actin抗體(1∶500)、Iba-1抗體(1∶1 000)、TNF-α抗體(1∶1 000)、磷酸化p38MAPK抗體(1∶500)或IL-1β抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，洗膜后ECL顯影曝光，采用Image Lab3.0軟件進行灰度分析。蛋白表達水平以目標蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值表示。

1.6免疫熒光檢測 每組取5只大鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉下，打開胸腔經升主動脈灌注預冷的4%多聚甲醛250 mL。取出脊髓L4～6節段，經后固定和蔗糖脫水后制成冰凍切片。經0.3% TritonX-100破膜和正常山羊血清室溫封閉后，加入抗Iba-1抗體(1∶600)4 ℃孵育過夜。次日，PBS漂洗后避光加入Cy3標記的熒光二抗(1∶300)室溫孵育2 h。之后使用PBS洗去殘余二抗，加入4′6-二脒基-2-苯基吲哚，其中總細胞數由DAPI行核染色，甘油封片后于免疫熒光顯微鏡下觀察技術。Iba-1陽性細胞密度=Iba-1陽性細胞數/總細胞數(DAPI)。

2 結 果

隨著嗎啡鞘內注射次數增加，M組和Dex組甩尾實驗MPE逐漸下降(P<0.05)。與NS組比較，M組甩尾實驗MPE在注射嗎啡的第1、3、5、7天較高(P<0.05)；與M組比較，Dex組甩尾實驗MPE于注射嗎啡的第3、5、7天均較高(P<0.05)，見表1。

表1 3組不同時間點甩尾實驗MPE結果%)

a:P<0.05，與NS組比較；b:P<0.05,與M組比較

與NS組比較，M組大鼠脊髓Iba-1、IL-1β、TNF-α和p-p38蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，Iba-1陽性細胞密度也顯著增多(P<0.05)；與M組比較，Dex組大鼠脊髓Iba-1、IL-1β、TNF-α和p-p38蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，Iba-1陽性細胞密度明顯降低(P<0.05)，見表2，圖1、2。

a:P<0.05，與NS組比較；b:P<0.05,與M組比較

白色箭頭為Iba-1(小膠質細胞標記物)陽性細胞(紅色熒光)；a:P<0.05，與NS組比較；b:P<0.05,與M組比較

表2 3組大鼠脊髓Iba-1、IL-1β、TNF-α和p-p38蛋白表達水平的比較

a:P<0.05，與NS組比較；b:P<0.05,與M組比較

3 討 論

本實驗研究結果表明，鞘內注射右美托咪定可減輕連續注射嗎啡誘發的脊髓小膠質細胞增多和炎癥因子產生，繼而緩解大鼠嗎啡耐受。

參照文獻[2-3,8-9]，本研究采用鞘內連續7 d注射嗎啡15 μg的方法建立大鼠嗎啡耐受模型。本實驗行為學結果顯示，嗎啡注射7 d內大鼠甩尾實驗MPE均逐漸下降，提示大鼠嗎啡耐受模型建立成功。而與單純嗎啡注射組(M組)比較，鞘內注射右美托咪定1.5 μg (1次/天，共7 d)減輕了連續注射嗎啡所造成的甩尾實驗MPE下降，說明鞘內注射右美托咪定可緩解嗎啡耐受的形成。

研究表明，嗎啡耐受的形成機制可能與阿片類受體脫敏[9]、谷氨酸受體或轉運體功能障礙[10]相關。而近期研究表明脊髓小膠質細胞的過度激活可能在嗎啡耐受形成中發揮關鍵作用[1,3]。而右美托咪定是臨床上常用的鎮靜藥物，臨床研究表明椎管內注射右美托咪定可減少椎管內局部麻醉藥物的用量并增加鎮痛效果[1,3]。同時，動物研究顯示，右美托咪定可通過減少小膠質細胞過度激活緩解神經元凋亡[4]。而本研究結果表明，鞘內注射右美托咪定，可在緩解嗎啡耐受的形成的同時，還可顯著減少嗎啡誘發的脊髓小膠質細胞標記物Iba-1的過度表達和小膠質細胞密度增加，說明右美托咪定緩解嗎啡耐受的效果可能與其特異性抑制小膠質細胞的激活相關。

小膠質細胞可通過細胞特異性的p-p38信號通路激活[1,3]，分泌促炎因子(如IL-1β[1,3]、TNF-α[11])，干擾脊髓神經元的正常功能，從而參與介導嗎啡耐受的形成。而已有研究表明，右美托咪定抑制脊髓損傷模型中小膠質細胞介導的促炎因子釋放[5]。本研究結果與之一致，鞘內注射右美托咪定可減少嗎啡連續注射介導的脊髓促炎因子釋放，并抑制p-p38信號通路的激活。這提示，右美托咪定可能通過緩解嗎啡誘導的小膠質細胞p-p38信號通路激活，減少促炎因子的釋放，繼而緩解嗎啡耐受的形成。

綜上所述，鞘內注射右美托咪定可緩解嗎啡耐受的形成，其機制可能與抑制脊髓小膠質細胞介導的炎性反應相關。

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Effectsofintrathecaladministrationofdexmedetomidineonmorphinetoleranceandinflammatoryresponseinrats*

GongHongyan1,ZhengFang2,ZuoZhichao1,LiuJingjing1,WangQingzhi3,ZhaoGuoan1△

(1.DepartmentofAnesthesiology,FirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,Xinxiang,Henan453000,China;2.MedicalImagingCenter,FirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,Xinxiang,Henan453000,China;3.SchoolofBasicMedicalSciences,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang,Henan453000,China)

ObjectiveTo investigate the effects of intrathecal dexmedetomidine administration on the development of morphine tolerance and spinal inflammatory responses.MethodsThirty-three male SD rats weighing 180～200 g were randomly divided into 3 groups (n=11)：Saline group (group NS),Morphine group (group M) and Dexmedetomidine group (group Dex).Animals of group NS were intrathecally injected with 10 μL of saline daily for seven days;Animals in group M were intrathecally injected with 15 μg of morphine daily for seven days;Animals in group Dex were intrathecally injected with a mixture of 15 μg morphine and 1.5 μg dexmedetomidine daily for seven days.At 1,3,5 and 7 day of intrathecal injection,hot water tail-flick test were used to evaluate analgesic response to thermal stimuli.After the last episode of behavioral test,Western blot analysis was applied to determine the protein levels of Iba-1 (microglial marker),IL-1β,TNF-α and phospho-p38MAPK (p-p38) in the spinal cord.In addition,microglia in the spinal cord was immuno-stained with anti-Iba-1 antibody and the densities of microglia were calculated.ResultsIn group M and Dex,the values of maximal possible effect (MPE) in tail-flick test decreased gradually along with repeated morphine administration (P<0.05).Compared with group NS,the values of MPE in tail-flick test at 1,3,5 and 7 day of morphine tolerance were higher in group M (P<0.05).Compared with group M,the values of MPE in tail-flick test at 3,5 and 7 day of morphine tolerance were higher in group Dex (P<0.05).Compared with group NS,the spinal protein levels of Iba-1,IL-1β,TNF-α and p-p38 as well as the density of Iba-1 positive cells in group M were increased (P<0.05).However,Compared with group M,the of Iba-1,IL-1β,TNF-α and p-p38 as well as the density of Iba-1 positive cells were decreased(P<0.05).ConclusionIntrathecal dexmedetomidine administration can attenuate morphine tolerance by inhibiting microglia-mediated inflammatory responses in the spinal cord.

dexmedetomidine;morphine；drug tolerance;drug tolerance;inflammatory

影像中心,河南新鄉 453000；3.新鄉醫學院基礎醫學院,河南新鄉 453000)

河南省醫學科技攻關計劃項目(201204026)。

鞏紅巖(1980-)，副主任醫師，碩士，主要從事臨床麻醉學研究。△

，E-mail:13462371221@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.34.005

R641

A

1671-8348(2017)34-4771-03

2017-08-03

2017-09-05)