β-TCP/PLGA復(fù)合BMSCs聯(lián)合高壓氧修復(fù)海水浸泡兔橈骨骨缺損的作用研究*

張 淦，程迅生，陳肖松，馬武秀，陳聰聰，符來(lái)想

(中國(guó)人民解放軍第105醫(yī)院骨科，合肥 230031)

β-TCP/PLGA復(fù)合BMSCs聯(lián)合高壓氧修復(fù)海水浸泡兔橈骨骨缺損的作用研究*

張 淦，程迅生△，陳肖松，馬武秀，陳聰聰，符來(lái)想

(中國(guó)人民解放軍第105醫(yī)院骨科，合肥 230031)

目的探討β-磷酸三鈣/聚乳酸-羥基乙酸共聚物(β-TCP/PLGA)復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)聯(lián)合高壓氧修復(fù)海水浸泡骨缺損的療效。方法復(fù)蘇和傳代的BMSCs接種于β-TCP/PLGA支架上，構(gòu)建組織工程骨。60只新西蘭兔在雙側(cè)橈骨制作1.5 cm的骨缺損，經(jīng)海水浸泡3 h后，分成4組，A組：空白對(duì)照組；B組：?jiǎn)渭傿MSCs組；C組：BMSCs+高壓氧組；D組:β-TCP/PLGA+BMSCs高壓氧組。分別于術(shù)后4、8、12周分別X射線攝片處死后取橈骨。通過(guò)X線片、蘇木素-伊紅(HE)染色和免疫組織化學(xué)檢測(cè)，評(píng)價(jià)各組海水浸泡骨缺損修復(fù)效果。結(jié)果影像學(xué)檢查，術(shù)后12周A組骨缺損未完成修復(fù)，斷端硬化；B組骨缺損部分修復(fù)；C組骨缺損基本完成修復(fù)，髓腔未通；D組骨缺損完成修復(fù)，髓腔再通。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)骨痂灰度值D組>C組>B組>A組(P<0.05)。組織學(xué)觀察,術(shù)后12周，A組少量板層骨；B組少量板層骨形成，少量骨小梁生成；C組大量板層骨形成，骨小梁排列欠規(guī)則；D組大量板層骨形成，骨小梁排列規(guī)則。免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組表達(dá)骨鈣素(OCN)強(qiáng)度，術(shù)后4周最強(qiáng)，術(shù)后8周減弱，術(shù)后12周達(dá)到最低。術(shù)后4周和8周，OCN表達(dá)強(qiáng)度D組>C組>B組>A組(P<0.05)，術(shù)后12周各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論β-TCP/PLGA復(fù)合BMSCs聯(lián)合高壓氧是修復(fù)海水浸泡骨缺損的有效方法之一。

β-磷酸三鈣/聚乳酸-聚羥乙酸；骨缺損；海水浸泡；高壓氧；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

海水浸泡骨缺損與單純的骨缺損有著明顯不同，表現(xiàn)在骨膜成骨能力下降[1]，相關(guān)的生長(zhǎng)因子表達(dá)延遲和下降[2]，給治療帶來(lái)困難。骨組織工程是治療骨缺損的有效措施[3],包括種子細(xì)胞、生長(zhǎng)因子和支架3個(gè)要素。聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)是應(yīng)用最為廣泛的高分子材料支架之一，但是PLGA水溶性差，缺少骨誘導(dǎo)能力，代謝產(chǎn)物會(huì)引起免疫反應(yīng)，力學(xué)性能差。實(shí)驗(yàn)證明可以通過(guò)增加β-磷酸三鈣(β-TCP)改變其性能[4]。β-TCP/PLGA在單純骨缺損中發(fā)揮重要的作用，但在海水浸泡骨缺損中是否也可以起到很好的作用尚不明確，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1主要材料 β-TCP/PLGA(山東省醫(yī)用高分子材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)；臺(tái)式離心機(jī)(湖南湘儀儀器有限公司)；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)高壓氧艙 (上海楊園醫(yī)用氧艙廠)；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)完全培養(yǎng)基、BMSCs(廣東賽業(yè)生物科技有限公司)；磷酸鹽緩沖液(美國(guó)Sigma公司)；乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣液、4%多聚甲醛(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)分組 60只新西蘭兔，體質(zhì)量2.5～3.0 kg,雌雄不限，采用隨機(jī)數(shù)表法隨機(jī)分成4組，每組15只。A組：空白對(duì)照組；B組：?jiǎn)渭傿MSCs組；C組：BMSCs+高壓氧組；D組:β-TCP/PLGA/BMSCs+高壓氧組。

1.3骨缺損模型制備和高壓氧治療 參照馬武秀等[5]的方法，兔耳緣靜脈3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉,剪去前肢前臂前外側(cè)毛，常規(guī)消毒鋪巾，在前臂中間前外側(cè)做3～5 cm的縱行切口，逐層分離皮下組織、筋膜、肌肉、骨膜直至暴露橈骨，注意避開(kāi)血管和神經(jīng)。制作1.5 cm的骨缺損，立即將前肢置于事先制備好的海水浸泡3 h,隨后徹底清創(chuàng)，60只新西蘭兔按照實(shí)驗(yàn)分組分別植入預(yù)先制備好的組織工程骨或者單純的BMSCs，空白對(duì)照組不植入任何材料。逐層縫合肌肉、筋膜和皮膚。連續(xù)3 d給予青霉素40萬(wàn)U肌肉注射。C、D組給予高壓氧處理，高壓氧治療參照陳聰聰?shù)萚6]的方法,術(shù)后立即給予高壓氧治療，每天1次，連續(xù)14 d。

1.4觀察指標(biāo) (1)X線片觀察：術(shù)后4、8、12周各組抽取4只兔麻醉后行雙側(cè)橈骨正位X射線攝片檢查。于圖片骨缺損間隙隨機(jī)選取5個(gè)觀察點(diǎn)，用Photoshop 7.0軟件分析并計(jì)算各觀察點(diǎn)骨痂灰度值。(2)蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察：術(shù)后4、8、12周隨機(jī)抽取4只兔攝片后處死，取橈骨中段。4%多聚甲醛固定，EDTA脫鈣1個(gè)月，乙醇梯度脫水，包埋，石蠟切片，沿橈骨縱軸行切片厚度為5 μm。行HE染色，觀察新生骨形成和移植材料的殘余。(3)免疫組織化學(xué)檢測(cè)：抗骨鈣素(OCN)單克隆抗體為一抗，在術(shù)后4、8、12周對(duì)組織行免疫組織化學(xué)染色。

2 結(jié) 果

2.1BMSCs細(xì)胞形態(tài)觀察 細(xì)胞接種2～3 h即可貼壁生長(zhǎng)，在倒置相差顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞呈梭形或橢圓形，細(xì)胞呈漩渦狀生長(zhǎng)，7～9 d細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿90%，見(jiàn)圖1。

2.2流式細(xì)胞鑒定結(jié)果 細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)CD29、CD44，陰性表達(dá)CD34、CD45，見(jiàn)圖2。

2.3X線片檢查結(jié)果 術(shù)后4周，A組有少量云霧狀骨痂影形成，B組云霧狀骨痂影較A多，C組云霧狀骨痂影較B組多，D組大量骨痂影形成，較C組多。術(shù)后8周，B、C、D組新生骨痂量進(jìn)一步增多， A組骨痂少量增加。術(shù)后12周，A組斷端硬化，形成骨不連；B組缺損區(qū)未完成修復(fù)，出現(xiàn)大塊缺損；C組骨缺損基本完成修復(fù)，髓腔未完全再通；D組骨缺損完成修復(fù)，髓腔再通，塑性良好，見(jiàn)圖3。各組不同時(shí)間點(diǎn)骨痂灰質(zhì)度D組>C組>B組>A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.4HE染色結(jié)果 術(shù)后4周A組缺損區(qū)可見(jiàn)少量纖維性骨痂形成，以軟骨細(xì)胞為主；B、C、D組可見(jiàn)軟骨性骨痂，可見(jiàn)成骨細(xì)胞，其中D組最多，C組少于D組，B組少于C組。術(shù)后8周，A組缺損區(qū)見(jiàn)大量纖維組織，可見(jiàn)少量成骨細(xì)胞；B組新生骨增多，出現(xiàn)大量不規(guī)則的骨小梁；C組出現(xiàn)大量新生骨，出現(xiàn)排列較為整齊的骨小梁，并且出現(xiàn)少量板層骨；D組新生骨進(jìn)一步增多，大量排列規(guī)則的骨小梁形成，可見(jiàn)成熟的板層骨。術(shù)后12周，A組少量板層骨形成，缺損區(qū)被大量纖維組織填充；C組板層骨形成，骨小梁排列規(guī)則，髓腔未完全再通；D組大量板層骨形成，缺損區(qū)已經(jīng)被新生骨完全填充修復(fù)，髓腔形成，髓腔內(nèi)大量血細(xì)胞，可見(jiàn)大量哈弗式系統(tǒng)。見(jiàn)圖4。

A：CD44+/CD34-；B：CD29+/CD45

圖2 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)骨痂灰質(zhì)度檢測(cè)結(jié)果(n=45)

a：P<0.05，與同時(shí)間點(diǎn)A組比較；b：P<0.05，與同時(shí)間點(diǎn)B組比較；c：P<0.05，與同時(shí)間點(diǎn)C組比較

圖3 影像學(xué)檢查

A：A組；B：B組；C：C組；D:D組

圖4術(shù)后12周各組HE染色(×100)

A：A組；B：B組；C：C組；D:D組

圖5免疫組織化學(xué)檢測(cè)術(shù)后4周各組OCN表達(dá)

2.5免疫組織化學(xué)結(jié)果 OCN主要表達(dá)于成骨細(xì)胞，各組表達(dá)OCN強(qiáng)度，于術(shù)后4周最強(qiáng)(圖5)，術(shù)后8周減弱，術(shù)后12周達(dá)到最低。術(shù)后4周和8周，OCN表達(dá)強(qiáng)度D組>C組>B組>A組(P<0.05)，術(shù)后12周各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)OCN表達(dá)水平

a：P<0.05，與同時(shí)間點(diǎn)A組比較;b：P<0.05，與同時(shí)間點(diǎn)B組比較；c：P<0.05，與同時(shí)間點(diǎn)C組比較

3 討 論

BMSCs在組織工程中是應(yīng)用最為廣泛的種子細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)不表達(dá)特異性的細(xì)胞表面分子，使得鑒定干細(xì)胞變得困難。目前主要通過(guò)排除法鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞傳至5代后，CD44、CD29陽(yáng)性表達(dá)，CD34、CD45陰性表達(dá)，結(jié)果與王鯤等[7]的研究一致，證明用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞具有MSC的特征。Kang等[8]使用異體BMSCs，因?yàn)樽泽wBMSCs從髂前上棘鉆孔抽取，會(huì)增加感染概率，引起疼痛。同時(shí)異體BMSCs不會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)，因?yàn)槿狈Ρ磉_(dá)人類白細(xì)胞抗原Ⅱ(HLA-Ⅱ)。實(shí)驗(yàn)使用異體BMSCs修復(fù)兔骨缺損并未出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)，HE染色未見(jiàn)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，影像學(xué)檢查和組織學(xué)觀察，表明自體BMSCs移植與異體BMSCs效果相似。在本實(shí)驗(yàn)中的HE染色，未見(jiàn)免疫細(xì)胞存在新生骨周?chē)?表明β-TCP/PLGA支架材料生物相容性良好。

β-TCP具有良好的生物相容性和生物降解性，研究表明其可以促進(jìn) MSC 的增殖和成骨分化[9]，Masaoka等[10]報(bào)道了β-TCP有骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性，參與了獼猴股骨缺損修復(fù)的過(guò)程。PLGA具有良好的生物降解性和可塑性，可應(yīng)用于骨治療。由于降解產(chǎn)物集聚在移植區(qū)域，免疫細(xì)胞會(huì)抑制PLGA周?chē)墓墙M織再生，PLGA移植會(huì)引起免疫反應(yīng)。在本實(shí)驗(yàn)中組織學(xué)切片未發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和明顯的免疫反應(yīng)，在觀察期間D組未發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)。Yoshida等[11]報(bào)道了PLGA/β-TCP未刺激免疫反應(yīng)產(chǎn)生，和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一樣?？赡茉蚴铅?TCP為堿性能中和PLGA所產(chǎn)生的酸性。此外BMSCs也起到一定的作用[12]。

材料在動(dòng)物體內(nèi)的降解主要有兩種途徑，一是材料在體液中發(fā)生溶解，其二是破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的吞噬作用使支架降解[13-15]。材料的降解產(chǎn)生大量的鈣離子和磷酸根離子，為新生骨的形成提供大量的物質(zhì)原料，加速了骨缺損修復(fù)。Bizenjima等[16]用TRAP染色檢驗(yàn)破骨細(xì)胞的活性，研究表明在移植后4周殘余支架表面存在破骨細(xì)胞，表明破骨細(xì)胞參與支架的降解過(guò)程。支架的力學(xué)性能也是衡量支架的一個(gè)重要指標(biāo)，支架良好的力學(xué)性能能在降解過(guò)程中起到支撐作用。本實(shí)驗(yàn)用PLGA增加材料的力學(xué)強(qiáng)度，避免了支架的過(guò)早塌陷，保持了良好的空間結(jié)構(gòu)，為新生骨組織的長(zhǎng)入提供支撐。Kang等[4]的實(shí)驗(yàn)在β-TCP的基礎(chǔ)上添加PLGA使得PLGA/β-TCP的抗壓強(qiáng)度從2.90 MPa增強(qiáng)到4.19 MPa,彎曲強(qiáng)度從1.46 MPa增強(qiáng)到2.41 MPa,韌性從0.17 MPa增強(qiáng)到1.44 MPa。并且PLGA/β-TCP的細(xì)胞附著性，細(xì)胞增殖能力和誘導(dǎo)活性未改變。骨缺損修復(fù)是一個(gè)新生組織不斷長(zhǎng)入支架內(nèi)，使得支架的整體力學(xué)強(qiáng)度不斷增加，同時(shí)支架不斷降解，為新生骨生長(zhǎng)提供空間的復(fù)雜過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)表明PLGA/β-TCP是合適的骨組織工程支架。

本研究中給予高壓氧處理，其作用如下：(1)高壓氧提高動(dòng)脈血氧分壓，增加彌散距離，改善組織的氧供。(2)高壓氧促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞增生及膠原纖維合成。促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的形成，改善血液循環(huán)和加強(qiáng)組織營(yíng)養(yǎng)，加速骨組織修復(fù)[17]。(3)高壓氧抗感染，高壓氧抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，提高吞噬細(xì)胞吞噬壞死組織的能力，加速壞死組織清除[18]。

本實(shí)驗(yàn)將BMSCs與β-TCP/PLGA支架復(fù)合后，在體外構(gòu)建成組織工程骨，移植入海水浸泡兔橈骨骨缺損模型。X射線攝片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，術(shù)后4周β-TCP/PLGA復(fù)合BMSCs組新生骨痂最多，其余組少量骨痂，隨著時(shí)間的增加骨痂逐漸增多。至術(shù)后12周，D組實(shí)現(xiàn)骨性連接恢復(fù)，髓腔再通，塑形良好，組織學(xué)見(jiàn)大量規(guī)則骨小梁，哈弗氏系統(tǒng)形成，生物力學(xué)優(yōu)于其他組。證實(shí)β-TCP/PLGA植骨材料的骨缺損修復(fù)效果優(yōu)于其他組。說(shuō)明實(shí)驗(yàn)用的β-TCP/PLGA搭載BMSCs聯(lián)合高壓氧是有效的治療海水浸泡骨缺損的方法。

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Studyontheeffectofβ-TCP/PLGAscaffoldsseededBMSCscombingwithhyperbaricOxygenonbonedefectwithseawaterimmersinginrabbitradius*

ZhangGan,ChengXunsheng△,ChenXiaosong,MaWuxiu,ChenCongcong,FuLaixiang

(DepartmentofOrthopedics,the105thHospitalofChinesePeople′sLiberationArmy,Hefei,Anhui230031,China)

ObjectiveTo investigate therapeutic effects of β-TCP/PLGA scaffolds seeded bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) combing with hyperbaric oxygen (HBO) on bone defect with seawater immersing in rabbit radius.MethodsBMSCs were seeded into the β-TCP/PLGA scaffolds to construct tissue engineering bone.60 New Zealand rabbits were created 1.5 cm bone defect in bilateral radius,and then bilateral wound limbs were immersed in seawater for 3 h.After debridement,all rabbits were randomly divided into 4 groups.In group A nothing was implanted into the bone defect.Only BMSCs was implanted in group B.BMSCs+HBO was given in group C.β-TCP/PLGA BMSCs+HBO was given in group D.At postoperative 4,8,12 weeks rabbits were sacrificed after radiography radius.X-ray radiography,HE staining,immunohistochemical observation were used to evaluate repairing effect of bone defect with seawater immersing.ResultsRadiographic analysis demonstrated that the bone defects were completely repaired with recanalization of the medullary cavity in group D,bone defects were partially repaired with partial recanalization of the medullary cavity in group C,bone defects were incompletely repaired in group B；bone defect repair unfinished and the broken ends were sclerous in group A.Each time point group D>group C>group B>group A in callus grey value (P<0.05).HE staining indicated after 12 weeks,a small amount of lamellar bone formated in group A;a small amount of lamellar bone formated in group B;a large amount of lamellar bone formated in group C;a large amount of lamellar bone formated in group D.Immunohistoehemical result indicated at postoperative 4 weeks，the expressions of osteocalcin(OCN) in each group were at high levels,the expressions decreased significantly at postoperative 8 weeks，the expressions were at a low level at postoperative 12 weeks．At postoperative 4 and 8 weeks，the expression levels of OCN were group D>group C>group B>group A (P<0.05),there was no significant difference at postoperative 12 weeks between the 4 groups (P>0.05)．Conclusionthe β-TCP/PLGA composite BMSCs combined hyperbaric oxygen is the effective method to repair seawater immersed bone defect in rabbit.

β-TCP/PLGA;bone defect;seawater immersing;hyperbaric oxygen;BMSCs

南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新重點(diǎn)課題(11Z011)。

張淦(1988-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事骨折愈合機(jī)制的研究?！?/p>

，E-mail:18909696280@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.34.004

R681

A

1671-8348(2017)34-4766-05

2017-08-01

2017-09-03)