A型肉毒素預防人瘢痕成纖維細胞增生機制的初步研究*

郝榮濤，李宗超，陳 興，葉 偉

(重慶市中醫院皮膚美容科 400021)

論著·臨床研究

A型肉毒素預防人瘢痕成纖維細胞增生機制的初步研究*

郝榮濤，李宗超，陳 興，葉 偉△

(重慶市中醫院皮膚美容科 400021)

目的探究不同濃度A型肉毒素(BTX-A)對瘢痕成纖維細胞的影響，初步闡釋BTX-A治療瘢痕及預防術后瘢痕增生的相關分子作用機制。方法選取人瘢痕成纖維細胞，以不同濃度的BTX-A(0.01、0.10、1.00 U/L 及10.00 U/L)作用24 h后，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞黏附及骨架變化，并采用MTT及流式技術檢測其增殖、凋亡及周期變化，同時采用實時熒光定量PCR(qRCR)及蛋白免疫印跡(Western blot)方法，探究TGF-β、基質金屬蛋白酶(MMP)-1、 MMP-2及MMP-9基因及蛋白的表達變化。結果隨著BTX-A劑量的升高，其細胞黏附數量及骨架熒光強度逐漸減弱；細胞增殖能力減弱且主要阻斷在細胞G0/G1期；此外其凋亡也隨著BTX-A劑量增大而逐漸增強。qPCR及Western blot結果顯示，隨著BTX-A劑量增大，MMP-1及MMP-2基因及蛋白均呈現高表達，而TGF-β及MMP-9呈現出低表達。結論BTX-A通過阻斷瘢痕細胞G0/G1期抑制其增殖，同時提高MMP-1及MMP-2的表達來減輕瘢痕形成，對瘢痕的治療起著積極的作用。

肉毒桿菌毒素,A型；瘢痕細胞；成纖維細胞；分子機制

瘢痕是當今國內外醫學界一直未攻克的難題，由于其發病率及術后復發率高，對患者的身心健康影響較大，且尚無行之有效的治療手段[1-4]。當前注射治療的藥物主要為曲安奈德等激素，有效率較高，但藥物本身有較多的不良反應[5-6]。而A型肉毒素(botulinum toxin type A，BTX-A)的安全性得到了大量臨床研究的證實，不良反應較小，應用于手術切口能促進切口愈合，并且可以減輕傷口瘢痕或瘢痕增生的程度[7]；但BTX-A對瘢痕成纖維細胞具體的影響及其對瘢痕細胞調控的分子及其機制目前還尚不清楚。本實驗通過不同濃度的BTX-A作用于瘢痕成纖維細胞，初步探究其影響及分子作用機制，為BTX-A在瘢痕防治領域的臨床運用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 本研究選用的細胞為原代培養的人瘢痕成纖維細胞，培養血清為杭州四季青有限公司胎牛血清，DMEM低糖培養基購自Hyclone公司。實驗中采用的BTX-A購于蘭州生物制品研究所有限責任公司(國藥準字S10970037)，四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑為美國Sigam公司產品，免疫熒光中細胞骨架抗體Actin-tracker Green為上海碧云天生物有限公司產品。引物由上海生物有限公司合成，PCR采用的反轉錄及相關試劑盒均購于美國Promega公司。蛋白免疫印跡(Western blot)中需要的一抗及貨號信息見表1，細胞凋亡Annexin V/碘化丙啶(PI)試劑盒、辣根過氧化物標記的山羊抗鼠及山羊抗兔二抗均購于武漢博士德生物有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將前期原代培養的瘢痕成纖維細胞復蘇，并在含10%的胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素的DMEM低糖培養基中孵箱2～3 d后傳代，用于后續實驗。

1.2.2細胞增殖 取生長及形態良好的細胞，胰酶消化重懸后以每孔1×105/100 μL的密度接種到96孔板中，當細胞生長到50%融合后去除培養基，用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，加入提前配置好的含有不同濃度BTX-A的培養基，分別是0、0.01、0.1、1.0 U/L及10 U/L，繼續培養24 h后采用MTT檢測細胞增殖。每組設置6個復孔，檢測其570 nm吸光度(A)值。

表1 一抗相關信息

1.2.3細胞形態變化觀察 取生長及狀態良好的瘢痕成纖維細胞消化重懸后接種于鋪有無菌蓋玻片的24孔板中，待細胞生長到70%融合后去除培養基，無菌PBS清洗后加入不同濃度梯度BTX-A的培養基。繼續培養24 h后移去培養基，無菌PBS清洗，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%Triton-X處理10 min，加入正常山羊血清封閉30 min，不洗加入稀釋比例為1∶100的Actin-tracker Green，保濕暗盒放置2 h，PBS清洗，DAPI染核5 min，抗熒光猝滅劑封片，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4細胞周期及凋亡檢測 細胞培養及處理方法同前，細胞經過不同濃度的BTX-A處理后，4 ℃低溫離心5 min收集細胞，預冷的PBS清洗細胞3次，繼續離心，調整細胞濃度為1×105/mL。然后去除上清液，加入70%的乙醇固定3 h，PBS清洗后加入RNAse A,并在37 ℃水浴30 min，最后加入400 μL的碘化丙啶(PI)液混勻，避光0.5 h后上機檢測周期變化。細胞在計數后，加入500 μL結合緩沖液用于凋亡檢測，用5 μL Annexin V-FITC和10 μL的PI保濕濕暗盒中孵育5 min后400目篩網過濾后上機檢測，Winmdi軟件分析細胞凋亡率。

1.2.5qPCR檢測相關基因表達 細胞經不同濃度BTX-A處理后采用 Trizol 試劑提取總RNA，電泳鑒定 RNA，紫外分光光度計測定濃度，以1 μg RNA總量反轉錄合成cDNA；在 PE5700 實時熒光定量 PCR 儀上進行實時定量擴增。反應總體系 20 μL，qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1.0 μL，cDNA 2.0 μL，ddH2O 6 μL。反應條件：94 ℃ 5 min；93 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40個循環。每個實驗重復3次，采用相對定量2-ΔΔCt法比較各組細胞相關基因水平。引物序列見表2。

1.2.6Western blot檢測相關蛋白表達 細胞經不同濃度BTX-A處理后，用細胞裂解液提取細胞總蛋白，使用 BCA 蛋白濃度檢測試劑盒檢測樣品蛋白濃度，取 30～50 μg 總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濕轉法轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用 5%脫脂奶粉封閉 2～4 h，一抗于4 ℃條件下過夜，二抗室溫孵育2 h。其后采用ECL 顯色試劑盒于凝膠成像儀中觀察相關蛋白表達情況。最后采用Image J軟件對Western blot條帶進行分析。

表2 引物序列

2 結 果

2.1BTX-A影響細胞黏附及形態變化 與BTX-A相比，BTX-A各處理組細胞形態發生明顯變化。0 U/L組細胞貼附較好，鋪展較開，呈現出規律排列。隨著BTX-A劑量的升高，細胞貼附面積逐漸變小且具有逐漸脫落的趨勢，整體細胞形態相比0 U/L組細小。從各個視野細胞核的數量來看，隨著BTX-A劑量的增加其細胞數量逐漸減少，見圖1。

圖1 激光共聚焦顯微鏡觀察不同濃度BTX-A作用

2.2細胞增殖變化情況 在不同濃度BTX-A處理后，細胞增殖具有較大變化。與0 U/L組比較0.01 U/L組細胞增殖能力具有輕微增加的趨勢，但差異無統計學意義(P<0.05)。當濃度達到0.10 U/L時，細胞增殖明顯降低，且隨著BTX-A劑量的增加，增殖能力進一步降低，各組與0 U/L組比較差異有統計學意義(P<0.01)，見圖2。

a：P<0.01

圖2不同濃度BTX-A作用瘢痕成纖維細胞后細胞增殖能力變化情況

2.3細胞周期變化及凋亡情況 與0 U/L組相比，BTX-A各處理組細胞G0/G1期明顯增多，差異有統計學意義(P<0.01)，見表3。BTA-A各處理組細胞總凋亡率與0 U/L組比較增加，差異有統計學意義(P<0.01)，但早期凋亡率差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表3 各處理組細胞周期變化情況

a:P<0.01,與0 U/L組比較

表4 各處理組細胞凋亡變化情況

a:P<0.01,與0 U/L組比較

2.4基因表達變化情況 瘢痕細胞經BTX-A處理后，MMP-1與MMP-2的表達逐漸升高。當BTX-A濃度達到1.00 U/L時，與0 U/L組相差異有統計學意義(P<0.01)。而TGF-β及MMP-9的表達隨著BTX-A濃度的增加而出現低表達的趨勢，且具有明顯的劑量效應，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖3。

2.5蛋白表達變化情況 BTX-A各處理組MMP-1蛋白的表達與0 U/L組比較明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)；但其余各濃度梯度組之間差異無統計學意義(P>0.05)。MMP-2蛋白的表達也呈現出高表達趨勢，與0 U/L組比較差異有統計學意義(P<0.01)；此外，1.00 U/L組與10.00 U/L組表達量也明顯較0.01 U/L及0.10 U/L高。BTX-A各處理組TGF-β及MMP-9均有表達降低的趨勢，但BTX-A各處理組MMP-9表達與0 U/L組比較差異無統計學意義(P>0.05)，然而0.10 U/L組TGF-β與0 U/L組比較差異有統計學意義(P<0.01)，見圖4。

A：MMP-1;B:MMP-2;C:MMP-9;D:TGF-β；a：P<0.05；b：P<0.01，與0 U/L比較

圖3不同濃度BTX-A作用瘢痕成纖維細胞后MMP-1、MMP-2、MMP-9及TGF-β基因表達

A：Western blot；B:半定量分析結果；a：P<0.01

圖4不同濃度BTX-A作用瘢痕成纖維細胞后MMP-1、MMP-2、MMP-9及TGF-β蛋白表達變化

3 討 論

正常的創傷后瘢痕為平坦的、相對狹窄的線性瘢痕。當傷口過度修復，發生增生性病變，便發展為增生性瘢痕和瘢痕疙瘩[8-9]。瘢痕疙瘩為皮膚損傷后，結締組織過度增生和透明變性而引起的良性皮膚腫瘤，為機體異常愈合的一種形式，有類似腫瘤無限增殖生長的方式[10]。其表現為皮膚損傷后，以膠原和大量細胞外基質的形成，在局部過度沉積。其原因為瘢痕疙瘩中膠原酶的活性高于正常皮膚，如Ⅰ型膠原的合成增加，使大量膠原沉積[11]。目前還不能確定其精確的發病機制。本研究發現，采用BTX-A作用于瘢痕成纖維細胞后細胞形態及黏附能力明顯發生變化，其增殖能力降低。這對預防瘢痕的過度增生有著積極的作用。

BTX-A是肉毒梭狀芽孢桿菌在繁殖過程中分泌的毒性蛋白質，為一種細胞外毒素，能特異性阻斷乙酰膽堿釋放，未稀釋的原藥具有很強的神經毒性[12]。根據抗原性的不同，可將其分為A、B、C、D、E、F、G 共7個亞型，而用于皮膚美容的為BTX-A。其相對分子質量為90×103，屬于高分子蛋白質[13]?，F有研究表明，BTX-A能抑制人增生性瘢痕成纖維細胞增殖和膠原蛋白的合成[1]。應用于手術切口能降低局部張力，促進切口愈合，可以減輕傷口瘢痕或瘢痕增生的程度。在不影響創面愈合的時間和速度的情況下，可下調大鼠TGF-β的表達[14]，同時也能影響人瘢痕組織TGF-β的生成[15]。在本研究中發現，BTX-A作用瘢痕成纖維細胞后其細胞骨架牽張力明顯變小，細胞骨架與對照組相比呈現出明顯的收縮狀。這也證實了BTX-A對瘢痕成纖維細胞牽張力的影響。同時本研究還發現，BTX-A作用瘢痕細胞后，TGF-β基因及蛋白的表達均明顯下調。此外從MMP-1、MMP-2及MMP-9基因及蛋白的表達情況來看，前兩者出現明顯高表達，然而的表達下降。

MMPs是一種鋅依賴性的中性蛋白酶家族，便于細胞在基質中的遷移，參與組織重塑，對疙瘩形成過程中細胞外基質的合成及降解的調控有重要作用，維持細胞外基質的動態平衡，參與人體許多病理及生理過程[16-17]。在瘢痕的形成過程中，MMPs起著十分重要的作用，特別是MMP-1、MMP-2和MMP-9等，是影響膠原降解的主要因素[18]。MMP-1和MMP-2在瘢痕的形成過程中被成纖維細胞穩定表達，以降解細胞外基質，便于細胞在基質中的遷移，參與組織重塑[19-21]。本研究發現，瘢痕成纖維細胞在BTX-A作用下，MMP-1與MMP-2明顯高表達，然而MMP-9表達出現下調，推測BTX-A作用下瘢痕成纖維細胞通過降低TGF-β的表達，進一步促進MMP-1及MMP-2的表達來增強細胞外基質的降解，進而降低瘢痕成纖維細胞膠原過度沉積的問題，對瘢痕疙瘩等的預防起到積極的作用。

綜上所述，BTX-A通過降低瘢痕成纖維細胞細胞骨架牽張力，抑制TGF-β的表達，進一步促進MMP-1與MMP-2的表達增強瘢痕組織細胞胞外基質及組織的重塑，從而對瘢痕的預防及治療起著積極的作用。但本研究僅對MMPs等分子進行了初步研究，TGF-β是如何對MMP-1與MMP-2調控，以及是否還有其他分子參與該過程還有待進一步研究。

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ApreliminarystudyonthemechanismofbotulinumtoxintypeAinpreventingtheproliferationofkeloidfibroblastcells*

HaoRongtao,LiZongchao,ChenXing,YeWei△

(DepartmentofSkinCosmetology,TraditionalChineseMedicineHospitalofChongqingCity,Chongqing400037,China)

ObjectiveTo investigate the effects of different concentrations of botulinum toxin type A on hypertrophic scar fibroblasts,and to explore the molecular mechanism of botulinum toxin type A in the treatment of scar and prevention of postoperative scar hyperplasia.MethodsDifferent concentrations of botulinum toxin A(0.01,0.1,1 U/L and 10 U/L) were used on hypertrophic scar fibroblasts for 24 hours,to observe the changes of cell adhesion and cytoskeleton under laser confocal microscopy.MTT and flow cytometry were used to detect the proliferation,apoptosis and cycle of change,at the same time real time fluorescence quantitative PCR and Western blot were conducted to detected the expression of TGF-β,matrix metalloproteinase MMP-1,MMP-2 and MMP-9 gene and protein expression changes.ResultsWith the increase of botulinum toxin A dose,the number of cell adhesion and cytoskeletal fluorescence intensity decreased,cell proliferation ability decreased and mainly blocked at G0-G1phase,and the apoptosis also increased with the dose increased.The results of qPCR and Western blot showed that MMP-1 and MMP-9 gene and protein were highly expressed with the increase of botulinum toxin A dose,while TGF-β and MMP-9 showed low expression.ConclusionBotulinum toxin A can inhibit the proliferation of hypertrophic scar fibroblasts and inhibit the expression of MMP-1 and MMP-2,which can inhibit scar formation.It plays a positive role in the treatment of scar.

] botulinum toxin type A;keloid;fibroblast;molecular mechanism

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.36.016

重慶市衛計委醫學科研項目(20142071)。

郝榮濤(1982-)，主治醫師，碩士，主要從事瘢痕防治的臨床及科研工作。△

，E-mail:cqzyyyw@sina.com。

R622

A

1671-8348(2017)36-5086-04

2017-08-22

2017-09-24)