miR-124 rs531564、miR-26A rs7372209和miR-126 rs4636297基因多態性與結直腸癌患者預后的相關性研究*

劉劍榮，陳小林

(江西省萍鄉市人民醫院檢驗科 337055)

論著·臨床研究

miR-124 rs531564、miR-26A rs7372209和miR-126 rs4636297基因多態性與結直腸癌患者預后的相關性研究*

劉劍榮，陳小林

(江西省萍鄉市人民醫院檢驗科 337055)

目的評估微RNA(miR)-124、miR-26A和miR-126基因單核苷酸多態性(SNP)對結直腸癌(CRC)患者預后的影響。方法以2011年7月至2013年12月該院收治的724例CRC住院患者為研究對象，利用PCR-連接酶檢測反應(PCR-LDR)技術對患者外周血miR-124 rs531564、miR-26A rs7372209和miR-126 rs4636297進行SNPs位點基因型分析。患者的總生存時間(OS)和無復發生存率(PFS)采用 Kaplan-Meier法計算，單變量log-rank 法比較SNPs不同的基因型和單倍體型對OS和RFS的影響。結果攜帶miR-124 rs531564 CG基因型的CRC患者手術治療后3年內OS較攜帶CC基因型的患者縮短，3年內因腫瘤死亡風險增加[HR2=1.450,95%CI(1.043～2.017)，P=0.026]；攜帶GG基因型的患者較攜帶CC型的患者3年內因腫瘤死亡風險亦增加[HR2=2.339，95%CI(1.171～4.674)，P=0.024]；在顯性基因模型中，攜帶CG+GG基因型的患者較攜帶CC基因型的患者預后3年內OS明顯下降[HR2=1.532,95%CI(1.119～2.096),P=0.008]；隱性基因模型中，攜帶GG基因型與攜帶CC+CG基因型患者的OS無明顯差異[HR2=1.975，95%CI(1.000～3.900)，P=0.052]；共顯性模型中，以CC+CG基因型為參照，攜帶CG基因型的患者OS降低，患者3年內因腫瘤死亡風險增加[HR2=1.395,95%CI(1.007～1.931)]。未發現miR-26A rs7372209位點和miR-126 rs 4636297位點基因多態性與CRC術后3年內OS和RFS相關(P>0.05)。結論miR-124 rs531564位點基因多態性是CRC患者預后的獨立影響因素。

miRNA-124；miRNA-26A；miRNA-126；多態性，單核苷酸；結直腸腫瘤；預后

雖然隨著臨床診斷和治療水平的不斷提高和更新，結直腸癌(colorectal cancer，CRC)的治療療效日益顯著，但其發病率和病死率依然排在我國常見惡性腫瘤前列[1-2]。大量研究表明，CRC是環境因素與相關基因交互作用的結果。探索相關基因與CRC的關系，對揭示其分子發病機制、設計合理的治療藥物、篩選更為特異有效的臨床診斷和預后判斷指標，以及進一步提高CRC的治療水平具有重要意義。隨著微RNA(microRNA，miRNA)調控機制研究的深入，大量報道已證實miRNA的表達或生物學功能改變與CRC的發生、發展等病理生理過程密切相關，其中部分miRNA已被證實在CRC發生和發展過程中發揮癌基因或抑癌基因作用[3-4]。miRNA在CRC組織中的表達還呈現時序性、組織差異性、個體差異性和種族差異性等特點，但其在各種不同組織來源和不同進展期的腫瘤中又具有一定的共性，使其可作為腫瘤早期診斷、鑒別診斷、分型分級及個體化治療的重要標志物[5-6]。CRC相關的miRNA及其靶基因中存在大量的遺傳多態性位點，如單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位點能夠影響miRNA和靶基因的轉錄和表達、二級空間結構及功能，是導致個體和種族間腫瘤發病風險和預后，以及藥物治療應答差異性的重要因素之一。因此，與CRC相關的miRNA和靶基因遺傳多態性位點被認為是評估CRC發病風險、判斷預后及預測藥物應答的潛在分子遺傳標志物。miRNA-124(miR-124)、miRNA-126(miR-126)和miRNA-26A(miR-26A)是近年來在CRC發生、發展過程中被發現發揮重要作用的分子。上述3個miRNA分子在CRC進展中都發揮抑癌基因作用，筆者推測其基因及靶基因遺傳多態性位點與判斷CRC預后及預測藥物應答有關聯。國內外尚未見miR-124、miR-126和miR-26A基因遺傳多態性與CRC患者預后相關性的研究報道，本研究進一步分析以上3個miRNA基因位點多態性與CRC手術治療預后的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 以2011年7月至2013年12月本院收治的CRC住院患者為研究對象。在所有被招募的CRC患者中，8例患者由于以下原因被排除：其中缺失明確的診斷3例，樣品不足2例，失訪1例，基因分型不明確2例。最后共納入符合標準的CRC患者724例，均為經組織病理確診的新發病例，并獲得患者基因分型數據和完整的基本臨床資料。患者年齡21～86歲，平均(53.5±9.9)歲；其中男415例，女309例。本研究進行的現場面對面調查均征得患者本人的知情同意。

1.2方法

1.2.1調查方法 采用回顧性調查結合前瞻性隨訪的研究方法，應用統一設計的調查問卷，通過查詢患者住院病歷和電話隨訪(直接聯系患者或其家屬)相結合的方式收集資料。電話隨訪截止日期為2013年12月30日。隨訪間隔：術后1年內為每3個月1次，1年后為每6個月1次。以3年內的總生存時間(overall survival，OS)和無復發生存率(recurrence-free survival，RFS)為最終評價指標，按月計算。OS為確診之日起到死亡(死于原發腫瘤或并發癥)或末次隨訪的時間；RFS為末次隨訪時間未出現死亡，確診之日起到首次出現復發、轉移或死亡的時間；復發轉移均經影像學檢查證實，出現復發灶、轉移(近端和遠端轉移)為事件終點，至末次隨訪時間未出現復發或轉移為截尾事件。

1.2.2基因組DNA提取 問卷調查結束后，經患者知情同意，取靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，按照TIANamp血液基因組DNA提取試劑盒說明抽提外周血基因組，提取的DNA -80 ℃保存備用，采用PCR-連接酶檢測反應(LDR)方法檢測miR-124 rs531564、miR-26A rs7372209和miR-126 rs4636297多態性基因分型，引物見表1。

1.3統計學處理 采用SPSS17.0進行統計分析，計數資料以例數或百分率表示。生存率計算采用Kaplan-Meier法，根據不同的基因型和單倍體型計算OS和RFS，比較采用log-rank法。Cox比例風險模型用于多變量生存分析，并計算不同基因型和單倍體型的OS和RFS風險比(HR)及其95%置信區間(95%CI)。采用Logistic回歸分析并調整年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤部位、化療結果。所有的統計檢驗均為雙側檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1患者基本臨床特征 隨訪顯示，724例患者中224例復發，210例死亡。患者基本臨床資料見表2。

表1 引物序列

表2 患者基本臨床資料(n=724)

2.2miRNA基因多態性與CRC患者術后3年內OS的相關性 在風險模型分析中，經過調整性別、年齡、吸煙史、飲酒史、腫瘤分化程度等因素后對miRNA位點進行3年內的OS分析，多因素Cox回歸分析結果顯示，攜帶miR-124 rs531564 CG基因型的CRC患者手術治療后OS較攜帶CC基因型的患者下降，患者術后3年內由于腫瘤死亡的風險增加[HR2=1.450，95%CI(1.043～2.017)，P=0.026]；攜帶GG基因型的患者較攜帶CC基因型的患者死亡風險亦增加[HR2=2.339，95%CI(1.171～4.674)，P=0.024]，見表3。在顯性基因模型中，攜帶miR-124 rs531564 CG+GG基因型的患者較攜帶CC基因型的患者OS明顯下降，3年內由于腫瘤死亡的風險增加[HR2=1.532，95%CI(1.119～2.096)，P=0.008]；隱形基因模型中，攜帶GG基因型的患者與攜帶CC+CG基因型的患者術后3年內OS無明顯差異[HR2=1.975，95%CI(1.000～3.900)，P=0.052]；共顯性模型中，攜帶CG基因型的患者OS較攜帶CC+CG基因型的患者降低，患者3年內由于腫瘤死亡的風險增加[HR2=1.395，95%CI(1.007～1.931)，P=0.045]；未發現miR-26A rs7372209和miR-126 rs4636297基因多態性與CRC術后3年內OS的相關性，見表4。

2.3miRNA基因多態性與CRC患者術后3年內RFS的相關性 多因素COX回歸分析結果顯示，攜帶miR-124 rs531564 GG基因型的CRC患者手術治療后RFS較攜帶CC基因型患者降低，患者3年內由于復發死亡的風險增加[HR2=2.920，95%CI(1.605～5.311)，P<0.001]；攜帶CG基因型的患者與攜帶CC基因型的患者由于復發死亡的風險無明顯差異[HR2=1.343，95%CI((0.998～1.808)，P=0.05)，見表5。在顯性基因模型中，攜帶miR-124 rs531564 CG+GG基因型的患者較攜帶CC基因型的患者RFS明顯下降[HR2=1.470，95%CI(1.110～1.946)，P=0.007]；隱形基因模型中，攜帶GG基因型較攜帶CC+CG基因型患者由于復發死亡的風險增加[HR2=2.589，95%CI(1.438～4.660)，P=0.001]；共顯性模型分析中，攜帶CG基因型的患者由于復發死亡的風險與攜帶CC+CG基因型的患者比較無明顯差異[(HR2=1.279，95%CI(0.954～1.715)，P=0.098]；未發現miR-26A rs7372209和miR-126 rs4636297基因多態性與CRC患者RFS的相關性，見表6。

表3 3個miRNA不同基因型基因多態性與CRC患者術后OS的相關性

表4 3個miRNA各基因模型中不同基因型與CRC患者術后OS的相關性

表5 3個miRNA不同基因型基因多態性與CRC患者術后RFS的相關性

表6 3個miRNA各基因模型中不同基因型與CRC患者術后RFS的相關性

3 討 論

近年來，miRNA基因多態性與惡性腫瘤之間的關聯性開始受到關注，并發現某些miRNA基因SNPs與乳腺癌、肺癌、結腸癌等惡性腫瘤的發生風險相關[7-8]。雖然miRNA并不直接編碼蛋白質，但是研究者普遍認為miRNA基因自身的多態性改變可能會通過影響miRNA的成熟及與下游靶基因的結合等過程，調控目的基因的轉錄、表達和生物學功能，最終影響個體對疾病的易感性及藥物治療的有效性等[9-10]。相關研究結果表明，miRNA基因SNPs與CRC的臨床療效和預后有一定的關聯性。目前有關miRNA基因SNPs與CRC患者手術預后的報道很少，而miRNA表達水平與CRC發病風險和預后關系的研究較多。本研究結果顯示，在校正年齡、性別、吸煙、飲酒等因素后，多因素Cox回歸分析結果顯示，攜帶miR-124 rs531564 CG基因型的CRC患者手術治療后OS較CC基因型患者縮短，患者死亡風險增加；同時攜帶GG基因型患者較攜帶CC基因型患者的死亡風險亦增加。對RFS的分析結果顯示，攜帶miR-124 rs531564 GG基因型的CRC患者手術治療后RFS較攜帶CC基因型的患者降低，患者由于復發死亡的風險增加；攜帶CG基因型的患者與攜帶CC基因型的患者由于復發死亡的風險無明顯差異。本研究結果還顯示，未發現miR-26A rs7372209和miR-126 rs4636297位點多態性與CRC患者術后OS及RFS的相關性(P>0.05)。

miR-124、miR-126和miR-26A是近年來在CRC發生、發展過程中新發現的發揮重要作用的分子。已有研究報道，miR-124是一個潛在的腫瘤抑制因子，并且可能成為CRC、前列腺癌和鼻咽癌等腫瘤預后的獨立標記物[11-12]。miR-124基因位于染色體的8p23，并有一個確定能影響miR-124表達的多態性位點(rs531564)。Pri-miR-124 rs531564基因多態性與相關癌癥發病風險的相關性已經有報道[13]。PKM1/2分子協助HNF4a轉錄因子結合miR-214基因的啟動子區上調miR-124的轉錄水平，高表達的miR-214可進一步激活線粒體凋亡信號通路促進CRC細胞的凋亡[14]。miR-124還可以通過與靶基因STAT3基因3′-UTR結合，促進CRC細胞的凋亡并抑制腫瘤的生長，進而發揮抑癌基因作用，同時miR-124還可調控PRRX1基因的表達提高CRC細胞系對放療的敏感性[15]。另一項研究表明，在CRC組織和細胞系中pri-miRNA-124的表達明顯下調，并且確定pri-miRNA-124是通過調控(iASPP)P53抑癌體系，進而對SW480和HT29細胞的增殖產生抑制作用[16]。這些結果闡明pri-miRNA-124/iASPP系統能調節CRC細胞的增殖，并認為miR-124可作為潛在的治療CRC的靶點。目前研究已表明，pri-miR-124 rs531564位點的基因多態性與CRC的發病風險增加相關[17-18]。

綜上所述，本研究通過對miR-124 rs531564、miR-26A rs7372209和miR-126 rs4636297多態位點與CRC患者術后的生存進行分析，發現miR-124 rs531564基因多態性是CRC患者預后的獨立因素，而miR-124 rs531564、miR-26A rs7372209兩個位點多態性均未發現與CRC的預后相關。本研究仍存在局限性與不足，由于CRC的發生是多基因及多環境因素聯合作用的復雜過程，因此，試驗結果仍需在不同地區人群和更大樣本中進行驗證，并對其預后發生機制進行深入研究。

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CorrelationanalysisofmiR-124rs531564,miR-26Ars7372209andmiR-126rs4636297polymorphismstotheprognosisofcolorectalcancer*

LiuJianrong，ChenXiaolin

(DepartmentofClinicalLaboratory,thePeople′sHospitalofPingxiangCity,Pingxiang,Jiangxi337055,China)

ObjectiveTo assess the influence of miRNA(miR)-124,miR-26A and miR-126 single nucleotide polymorphism (SNPs) on the prognosis in patients with colorectal cancer (CRC).MethodsA total of 724 cases of patients with CRC treated in this hospital from July 2011 to December 2013 served as the research subjects.The peripheral blood samples were collected,and genotype analysis of miR-124 rs531564,miR-26A rs7372209 and miR-126 rs4636297 SNPs locus were performed by using the PCR-LDR.The patient′s overall survival (OS) and progression-free survival (PFS) were calculated by using Kaplan-Meier method,and the univariate log-rank method was used to analyse the influence of different genotypes and haplotypes of SNPs on OS and PFS.ResultsThe OS after operation in CRC patient′s carrying miR-124 rs531564 CG genotype was decreased compared with that in patients carrying CC genotype,and the patient′s death risk was increased[HR2=1.450,95%CI(1.043-2.017)，P=0.026]; the patient′ s death risk in patients carrying GG genotype was also increased compared with that in patients carrying CC genotype[HR2=2.339,95%CI(1.171-4.674)]; in the dominant gene model,the OS in patients carrying CG+GG genotype was significantly decreased compared with patients carrying CC genotype[HR2=1.532,95%CI(1.119-2.096),P=0.008];in the recessive gene model,no statistically significant difference was found in OS between patients carrying GG genotype and those carrying CC+CG genotype[HR2=1.975，95%CI(1.000-3.900)，P=0.0052]; in the co-dominant model,compared with patients carrying CC+CG genotype,the OS in patients carrying CG genotype was decreased and their death risk was increased[HR2=1.395,95%CI(1.007-1.931)].There was no correlation of miR-26A rs7372209 locus and miR-126 rs4636297 locus gene SNPS to OS and PFS in CRC patients (P>0.05).ConclusionmiR-124 rs531564 gene polymorphism might be an independent influence factor of the prognosis in CRC patients.

] miRNA-124；miRNA-26A；miRNA-126；polymorphism，single nucleotide；colorectal neoplasms；prognosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.36.013

江西省衛生和計劃生育委員會基礎醫學研究項目(20157141)。

劉劍榮(1965-)，副主任技師，本科，主要從事臨床生化及分子生物學檢驗研究。

R446.1

A

1671-8348(2017)36-5076-05

2017-08-18

2017-09-26)