遠隔缺血后適應對急性心肌梗死再灌注治療患者血小板功能的影響*

錢云霞，何志松，楊向軍

(蘇州大學附屬第一醫院心內科，江蘇蘇州 215006)

論著·臨床研究

遠隔缺血后適應對急性心肌梗死再灌注治療患者血小板功能的影響*

錢云霞，何志松，楊向軍△

(蘇州大學附屬第一醫院心內科，江蘇蘇州 215006)

目的探討遠隔缺血后適應(RIPostC)對急性心肌梗死再灌注治療患者血小板功能的影響。方法入組2015年6月至2016年7月該院71名急性心肌梗死患者，均接受再灌注治療?；颊叻譃閮山M：處理組，接受RIPostC；對照組，接受假RIPostC。在經皮冠狀動脈介入術(PCI)之前、RIPostC后即刻、PCI術后24 h、PCI后48 h采集患者的靜脈血樣，用流式細胞儀檢測血小板活化指標CD62P 和PAC-1，和血小板凋亡指標線粒體跨膜電位(ΔΨm)。結果處理組PCI術后24 h血小板表面CD62P的表達明顯低于對照組(P<0.05)，而在其他時間點兩組差異無統計學意義(P>0.05)；兩組血小板PAC-1表達在各個時間點差異無統計學意義(P>0.05)；兩組患者血小板ΔΨm在各時間點差異也無統計學意義(P>0.05)。結論RIPostC能一定程度降低急性心肌梗死患者血小板的活化，不引起血小板早期凋亡。

心肌梗死；血小板活化；缺血后適應

急性心肌梗死最重要的治療方法是盡快恢復心肌的血液再灌注，但是再灌注治療有時候會引起組織細胞更大的損傷，這種現象稱之為缺血再灌注損傷[1]。既往研究表明，遠隔器官或組織的短暫性缺血能夠減少急性心肌梗死患者的心肌損傷，這種現象稱遠隔缺血適應。

遠隔缺血適應包括：遠隔缺血預適應(remote ischemic preconditioning，RIPreC)和遠隔缺血后適應(remote ischemic postconditioning，RIPostC)。兩者都能減少心肌細胞的再灌注損傷[2-5]。RIPreC需要在事件發生之前運用，因為難以預測事件何時發生，所以這在實踐中難以做到；而RIPostC在事件發生后立即實施，這一方法既安全、易行。有研究表明，血小板在缺血再灌注損傷中扮演重要的角色[6-7]。目前有研究表明RIPreC能降低人體血小板的活性[8-9]，而尚沒有研究揭示RIPostC對人體血小板功能的影響。所以本研究的目的在于明確RIPostC對急性心肌梗死患者血小板功能的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究主要入組2015年6月至2016年7月本院接受再灌注治療的急性ST段抬高心肌梗死患者。入組標準：(1)急性ST段抬高心梗；(2)首診90 min內接受經皮冠狀動脈介入術(percutaneous coronary intervention，PCI)治療。排除標準:(1) 既往無心肌缺血事件；(2) 無嚴重的肝腎功能不全；(3) 無血液系統疾病；(4) 無合并感染。71例患者納入研究，分為：處理組(n=37)接受RIPostC，對照組(n=34)接受假RIPostC。所有患者均簽署書面的知情同意書，此研究通過醫院的醫學倫理委員會批準。

1.2心肌再灌注治療 所有入組患者均接受急診PCI手術再灌注心肌。所有患者在術前均服用300 mg 阿司匹林和300 mg氯吡格雷抗血小板治療，術后每天服用100 mg阿司匹林和75 mg氯吡格雷。在術中和術后接受短時間低劑量(5 μg·kg-1·h-1)的替羅非班治療(21±10)h。

1.3RIPost C方法 所有入選患者在本院心血管內科導管室接受急診PCI術治療。術中對閉塞的罪犯血管實施第1次球囊擴張后3 min內應用RIPostC或假RIPostC。處理組用血壓計袖帶包繞患者一側上臂進行充氣加壓，充氣至200 mm Hg維持5 min，然后放氣至0 mm Hg維持5 min，此為1個循環，一共進行4次循環；對照組用血壓計袖帶包繞患者一側上臂，充氣至5～10 mm Hg維持5 min，然后放氣至0 mm Hg維持5 min，也進行4個循環。

1.4血小板功能檢測 (1)血小板的準備：在PCI手術前、RIPostC/sham RIPostC后即刻、PCI后24 h、PCI后48 h 4個時間點分別抽取患者靜脈血樣5 mL。富含血小板血漿和缺乏血小板血漿分別用不同的離心力制備(200×g,10 min 和1 300×g,15 min)。富含血小板血漿的血小板計數調整到3.0×1011/L。(2)血小板活化指標CD62P 和PAC-1 用流式細胞儀測定：富含血小板血漿加入 5 μL FITC標記的 P選擇素(BioLegend,USA) 在37 ℃暗室孵育15 min；5 μL富含血小板血漿加入 10μL FITC標記的 PAC-1(Becton Dickinson,USA) 在37 ℃暗室孵育15 min，然后用流式細胞儀(Beckman XL)檢測。(3)血小板線粒體膜電位的監測：在50 μL 富含血小板血漿加入 2 μmol/L JC-1在37 ℃暗室孵育15 min后上流式細胞儀檢測，用綠色熒光所占百分比來反映線粒體膜電位的變化。

2 結 果

2.1患者的臨床資料 兩組患者的冠心病的常見危險因素、罪犯血管、肝腎功能、低密度脂蛋白、血小板計數、藥物治療等。臨床特征差異無統計學意義。兩組患者的主要臨床特征見表1。

表1 兩組患者臨床特征

2.2血小板的活化指標 (1)處理組PCI術后24 h血小板表面CD62P的表達明顯低于對照組(51.1±8.6)%vs.(58.5±14.6)%(P=0.025)，而在其他時間點兩組差異無統計學意義(P>0.05)；(2)兩組血小板PAC-1表達在各個時間點差異無統計學意義(P>0.05)；(3)所有入組患者術后24 h血小板CD62P和PAC-1表達率最低。見表2和圖1。

2.3血小板線粒體膜電位的變化 線粒體膜電位的變化與血小板早期凋亡相關，兩組患者的血小板線粒體膜電位變化在各個時間點差異無統計學意義(P>0.05)。見表2和圖2。

表2 兩組患者血小板活化指標比較

A:入組所有患者的CD62P表達隨時間變化趨勢；B:處理組和對照組在不同時間點CD62P表達比較；C:入組所有患者的PAC-1表達隨時間變化趨勢;D:處理組和對照組在不同時間點PAC-1表達比較

圖1 CD62P(+)和PAC-1(+)血小板的表達

A:入組所有患者48 h內 JC-1綠染的血小板百分比隨時間變化趨勢；B:處理組和對照組在不同時間點JC-1綠染的血小板百分比對比

圖2 JC-1綠染的血小板百分比

3 討 論

急性心肌梗死最有效的治療方法是及時再灌注治療，但是再灌注治療的同時往往伴隨著再灌注損傷。降低血小板活性是減輕心肌再灌注損傷重要機制之一。先前的研究已證明，RIPreC可降低血小板的反應性。因為RIPreC在臨床實踐中不易開展，所以本研究探討RIPostC對血小板是否有相同的效應。

CD62P和 PAC-1 均為國內外公認的血小板活化標志物[10]。在本研究中，入選的患者均為急性ST抬高心梗患者并且接受PCI再灌注治療。其中RIPostC組，血小板CD62P的表達在術后24 h低于對照組，而在其他各個時間點兩組間差異無統計學意義。而兩組患者血小板PAC-1在各個時間點差異均無統計學意義。說明RIPostC能降低血小板CD62P的表達，而不能降低PAC-1。這是RIPostC對血小板作用不明顯還是因為其他原因還不得而知。本研究中，所有患者均接受了三聯抗血小板的治療，所以RIPostC未顯示出對PAC-1的影響。但是血小板CD62P表達在術后24 h在兩組患者間還是顯示出了差異性，提示RIPostC減少了血小板α 顆粒的脫顆粒與釋放。RIPostC對CD62P 與PAC-1 的不同影響可能存在以下幾個原因：(1)目前有研究表明抗血小板藥物對GPⅡb/Ⅲa的影響大于CD62P[11]；(2)PAC-1是早期活化的標記物，而CD62P是活化后期的標記物。在本實驗中RIPostC對血小板的早期影響可能被藥物所掩蓋(其中替羅非班平均使用21 h)，所以在PCI 術后24 h，RIPostC對血小板的影響才顯現出來。而在PCI術后48 h，血小板活化指標在兩組患者間差異無統計學意義(P>0.05)，推測RIPostC對血小板的影響持續時間不能達到48 h。

另外，抗血小板藥物使用過程中可能存在出血的并發癥。所以本研究也觀察了RIPostC對血小板凋亡的影響。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變作為細胞凋亡早期的一個檢測指標。在兩組患者間，JC-1綠染的血小板百分比差異無統計學意義，說明RIPostC未引起血小板的凋亡。

目前RIPostC對血小板功能影響的機制尚不明確。 RIPostC對缺血心肌的保護機制表明，遠隔器官釋放一些體液因子：如腺苷、阿片類物質、緩激肽、內源性NO等，通過傳入神經或血液循環作用于心臟，實現其心肌保護作用，其中內源性腺苷是非常重要的物質之一[12]。現有的研究表明，RIPreC對血小板的影響主要是通過內源性腺苷的釋放及其A2a受體的激活。應用腺苷受體拮抗劑茶堿類物質可使RIPreC對血小板的效應消失[8-9]。進一步研究表明，腺苷通過激活血小板表面的Gs蛋白偶聯的A2a受體，激活腺苷酸環化酶，導致血小板內環磷酸腺苷增加，鈣離子水平降低，從而抑制血小板活性[13-14]。所以筆者推測RIPostC對血小板功能的影響，可能也是通過遠隔器官釋放內源性腺苷，并激活其血小板表面A2a 受體發揮作用。

[1]Moens AL,Claeys MJ,Timmermans JP,et al.Myocardial ischemia/reperfusion-injury,a clinical view on a complex pathophysiological process[J].Int J Cardiol,2005,100(2):179.

[2]Wei M,Xin P,Li S,et al.Repeated remote ischemic postconditioning protects against adverse left ventricular remodeling and improves survival in a rat model of myocardial infarction[J].Circ Res，2011，108(10):1220-1225.

[3]Lavi S,D′Alfonso S,Diamantouros P,et al.Remote ischemic postconditioning during percutaneous coronary interventions:remote ischemic postconditioning-percutaneous coronary intervention randomized trial[J].Circ Cardiovasc Interv,2014,7(2):225-32.

[4]Xiong J,Liao X,Xue FS,et al.Remote ischemia conditioning-an endogenous cardioprotective strategy from outside the heart[J].Chin Med J(Engl),2011,124(14):2209-2215.

[5]Xu J,Sun S,Lu X,et al.Remote ischemic pre- and postconditioning improve postresuscitation myocardial and cerebral function in a rat model of cardiac arrest and resuscitation[J].Crit Care Med,2015,43(1):e12-18.

[6]Xu Y,Huo Y,Toufektsian MC,et al.Activated platelets contribute importantly to myocardial reperfusion injury[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2006,290(2):H692.

[7]Mirabet M,Garcia-Dorado D,Inserte J,et al.Platelets activated by transient coronary occlusion exacerbate ischemia-reperfusion injury in rat hearts[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2002,283(3):H1134-1141.

[8]Battipaglia I,Scalone G,Milo M,et al.Upper arm intermittent ischaemia reduces exercise-related increase of platelet reactivity in patients with obstructive coronary artery disease[J].Heart,2011,97(16):1298-1303.

[9]Stazi A,Scalone G,Laurito M,et al.Effect of remote ischemic preconditioning on platelet activation and reactivity induced by ablation for atrial fibrillation[J].Circulation,2014,129(1):11-17.

[10]Bigalke B,Lindemann S,Gawaz M.Platelet activation in acute coronary syndrome and interventional therapy[J].Hamostaseologie,2007,27(5):338-343.

[11]Goto S,Tamura N,Li M,et al.Different effects of various anti-GPⅡb-Ⅲa agents on shear-induced platelet activation and expression of procoagulant activity[J].J Thromb Haemost,2003,1(9):2022-2230.

[12]Kaur S,Jaggi AS,Singh N.Molecular aspects of ischaemic postconditioning[J].Fundam Clin Pharmacol,2009,23(5):521-536.

[13]Fuentes E,Pereira J,Mezzano D,et al.Inhibition of platelet activation and thrombus formation by adenosine and inosine:studies on their relative contribution and molecular modeling[J].PLoS One,2014,9(11):e112741.

[14]Suzuki T.Hetero-oligomerization and functional interaction between purinergic receptors expressed in platelets to regulate platelet shape change[J].Yakugaku Zasshi,2015,135(12):1335-1340.

Effectofremoteischemicpostconditioningonplateletfunctioninpatientswithmyocardialischemia-reperfusion*

QianYunxia,HeZhisong,YangXiangjun△

(DepartmentofCardiology,FirstAffiliatedHospitalofSuxhouUniversity,Suzhou,Jiangsu215006,China)

ObjectiveTo investigate the effect of remote ischemic postconditioning (RIPostC) on the platelet reactivity in the patients with acute myocardial infarction(AMI) receiving reperfusion therapy.MethodsSeventy-one cases of AMI entering the group

the reperfusion therapy.The patients were divided into the two groups.The treatment group received RIPostC,while the control group received sham RIPostC.The venous blood samples were collected before transcutaneous coronary intervention(PCI),instantly after RIPostC and at 24 h,48 h after PCI.The platelet activation indicators CD62P and PAC-1,and platelet apoptosis indicator mitochondrial transmembrane potential(ΔΨm) were measured by flow cytometry.ResultsCD62P expression on platelet surface at 24 h after PCI in the treatment group was significantly lower than that in the control group(P<0.05),but which at other time points had no statistical difference between the two groups(P>0.05);there was no statistical difference in platelet PAC-1 expression at each time point between the two groups(P>0.05);the platelet ΔΨm at each time point had no statistical difference between the two groups(P>0.05).ConclusionRIPostC can somewhat reduce platelet activation in AMI patients without causing platelet early apoptosis.

] myocardial infarction;platelet activation;ischemic postconditioning

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.36.011

國家自然科學基金資助項目(81400200)。

錢云霞(1978-)，主治醫師，博士，主要從事冠心病的研究。△

，E-mail:yang_xiangjun@163.com。

R541.4

A

1671-8348(2017)36-5071-03

2017-08-20

2017-09-22)